[發(fā)明專利]一種酪蛋白活性單肽及其制備方法與應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010277790.X
• 申請日: 2010-09-10
• 公開（公告）號: CN101993476A
• 公開（公告）日: 2011-03-30
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 趙謀明;崔春;趙海鋒;張清麗
• 申請（專利權(quán)）人: 華南理工大學
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;C12P21/06;A23C9/13
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 何淑珍

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉抑制酸乳發(fā)酵及儲藏的技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及從酪蛋白酶解液分離得到的具有促進酸乳發(fā)酵和抑制酸乳后酸化的生物活性單肽及其應用。

背景技術(shù)

酸乳是指在保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌的作用下，使用添加?(?或不添加?)乳粉(?全脂或脫脂)的乳進行乳酸發(fā)酵而得到的凝固乳制品，最終產(chǎn)品中必須含有大量的活菌。乳酸菌的發(fā)酵作用可以使乳白蛋白變成微細的凝乳粒，易于消化吸收，發(fā)酵過程中乳酸菌可以產(chǎn)生機體營養(yǎng)所必需的維生素、煙酸和葉。酸乳除了保留了牛奶的全部營養(yǎng)外,其與鮮奶最顯著的差異就是在于它還含有大量的乳酸及易于人體腸道健康的活性乳酸菌。

我國酸乳生產(chǎn)中所用的乳酸菌大多為國外購進的直投式發(fā)酵劑(Direct-to?vat?caulture，簡稱DVS)，繼代式酸乳菌種的應用量相當小。與液體菌種相比，直投式發(fā)酵劑的潛伏期要長得多。其發(fā)酵時間通常比使用傳統(tǒng)的翻代液體發(fā)酵劑要延長2～3小時左右，對于大型乳品廠，這是一個不容忽視的影響因素。因此，如何縮短直投式菌種的發(fā)酵時間，提高生產(chǎn)效率，以及如何采取有效手段在減少發(fā)酵劑使用量，同時保證產(chǎn)品品質(zhì)，來降低成本也是重要的研究方向。

在酸乳發(fā)酵過程中嗜熱鏈球菌和保加利亞乳桿菌具有生長互補的作用或稱為共生(Mutualism)，球菌的生長同時會促進桿菌的生長，而桿菌生長形成的代謝產(chǎn)物又保證球菌的生長。乳桿菌對酸乳的貢獻是分解蛋白質(zhì)、產(chǎn)酸，鏈球菌對酸乳的良好風味和感官品質(zhì)具有重要作用。酸乳在貨架期必須保持微生物活性和良好的質(zhì)構(gòu)和風味。即使冷藏在0～5℃條件下，乳酸菌的新陳代謝導致的后酸化現(xiàn)象依然存在，這造成過乳清析出、酸味過重甚至產(chǎn)生澀味。以上現(xiàn)象嚴重影響酸乳的品質(zhì)導致其保質(zhì)期被大大縮短。

因此，通過在酸乳中添加具有含有益生功能因子的酪蛋白生物活性肽，有效地促進酸乳發(fā)酵縮短發(fā)酵時間并且抑制酸乳再儲藏期間產(chǎn)生后酸化延長酸乳保質(zhì)期，對酸乳行業(yè)具有重大的經(jīng)濟價值和現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的不足，提供一種有牛乳來源的、高安全性的、具有可產(chǎn)業(yè)化的酪蛋白活性單肽及其制備方法與應用。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案。

一種酪蛋白活性單肽的制備方法與應用，包括如下步驟：

（1）在50℃～55℃，pH?6.0-7.5的條件下加入木瓜蛋白酶對酪蛋白進行酶解，得酶解液；

（2）當水解度達到9％～10％時，90～95℃加熱15～20min滅酶，終止酶解反應以控制生物活性肽的分子量；

（3）將滅酶活的酶解液依次通過膜分離、大孔樹脂、凝膠色譜、反相高效液相進行分離純化，即得所述生物活性肽。

上述的制備方法，步驟（3）中將滅酶活的酶解液在4℃下以6000?g離心20分鐘，將上清液經(jīng)超濾（取分子量小于3000道爾頓的組分）后，采用大孔樹脂NKA-II,?收集10-20%（w/w）乙醇洗脫液，接著采用Sephadex（葡聚糖凝膠）?G-25,流動相為去離子水，檢測波長220nm，按吸收峰順序收集；經(jīng)Sephadex?G-25分離得到的具有較強活性的組分再經(jīng)C₁₈高效液相色譜分離純化，分離條件為：5-40%乙腈和95-60%去離子水梯度洗脫，檢測波長220nm，按吸收峰順序收集。

本發(fā)明還提供了由上述制備方法制得的具有促進酸乳發(fā)酵和抑制酸乳后酸化的酪蛋白活性單肽。

上述酪蛋白活性單肽，通過液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜測定其分子量為801.4道爾頓，該活性單肽氨基酸序列如序列表中序列1所示。

所述的酪蛋白活性單肽可應用于酸乳發(fā)酵中，促進酸奶發(fā)酵，抑制酸奶后酸化。

????本發(fā)明采用了以上技術(shù)方案，具有如下優(yōu)點和效果：

1、本發(fā)明通過對酪蛋白酶解液的進一步分離、純化得到了氨基酸序列為NPSKENL的肽，該活性肽具有明顯縮短酸乳發(fā)酵時間和抑制酸乳后酸化作用。

2、本發(fā)明分離純化所得的生物活性肽是從酪蛋白中分離得到的乳源性肽，可以安全的添加的到酸乳中。

附圖說明??

圖1為Sephadex?G-25對酪蛋白酶解液的初步分離圖；

圖2為RP-HPLC對生物活性肽的分離純化圖；

圖3為實施方式中添加50ppm（w/w）生物活性單肽對酸乳發(fā)酵周期和空白對照對應酸乳發(fā)酵周期的影響曲線；

圖4為實施方式中添加50ppm（w/w）生物活性單肽對酸乳儲存期產(chǎn)酸的影響曲線和空白對照對應的影響曲線。