[發(fā)明專利]高啟動(dòng)強(qiáng)度寬宿主組成型表達(dá)質(zhì)粒pMMPc及其應(yīng)用

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010277565.6
• 申請(qǐng)日: 2010-09-09
• 公開（公告）號(hào): CN101955967A
• 公開（公告）日: 2011-01-26
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 許平;陶飛;徐友強(qiáng);馬翠卿
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/63
• 分類號(hào): C12N15/63;C12N15/53;C12N9/02
• 代理公司: 濟(jì)南金迪知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37219
• 代理人: 趙會(huì)祥

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及的是基因工程領(lǐng)域表達(dá)質(zhì)粒及應(yīng)用，尤其是關(guān)于高啟動(dòng)強(qiáng)度寬宿主范圍組成型表達(dá)質(zhì)粒pMMPc及其在生物降解和生物修復(fù)領(lǐng)域的應(yīng)用。

背景技術(shù)

基因表達(dá)系統(tǒng)在生物降解和生物修復(fù)領(lǐng)域具有重要作用，是進(jìn)行外源基因表達(dá)的重要工具。現(xiàn)在常用的基因表達(dá)系統(tǒng)，比如tac啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)、Tn7啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)以及一些光照誘導(dǎo)型或者溫度誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)系統(tǒng)等，都有一個(gè)共同的缺陷，即啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)需要額外添加誘導(dǎo)因子，如IPTG、溫度變化、光照變化等。這為生物降解和生物修復(fù)帶來了額外的操作，增加了成本，而且，在環(huán)境領(lǐng)域應(yīng)用時(shí)增加了表達(dá)系統(tǒng)實(shí)施的難度，并可能會(huì)給環(huán)境帶來負(fù)面的影響(Di?Gennaro?et?al.，2008；Choi?et?al.，2005)。因而，有必要開發(fā)新的不受上述限制的組成型表達(dá)質(zhì)粒。

芳烴類化合物是一類重要的致癌物質(zhì)，在環(huán)境中廣泛存在，不但對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重污染，而且嚴(yán)重威脅人類健康。利用微生物，通過生物降解和生物修復(fù)來消除環(huán)境污染已經(jīng)成為現(xiàn)在重要的研究課題。兒茶酚又稱鄰苯二酚，是許多芳烴類化合物代謝的中間產(chǎn)物。兒茶酚雙加氧酶能夠作用于芳烴類化合物代謝的中間產(chǎn)物鄰苯二酚，它催化苯環(huán)的鄰位裂解。這一特性使該酶在芳烴類化合物代謝中處于重要的地位，對(duì)消除芳烴類化合物的環(huán)境污染具有重要的意義。

參考文獻(xiàn)

Di?Gennaro?P，F(xiàn)errara?S，Bestetti?G，et?al.Novel?auto-inducing?expression?systems?for?the?development?of?whole-cell?biocatalysts.Appl?Microbiol?Biotechnol，2008，79：617-625.

Choi?K?H，Gaynor?J?B，White?K?G，et?al.(2005)A?Tn7-based?broad-range?bacterial?cloning?and?expression?system.Nat?Methods，2005，2：443-448.

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)現(xiàn)有質(zhì)粒的缺陷以及現(xiàn)階段環(huán)境污染的現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的是提供一種高啟動(dòng)強(qiáng)度寬宿主范圍的組成型表達(dá)質(zhì)粒，并使其應(yīng)用于在革蘭氏陰性菌中表達(dá)兒茶酚雙加氧酶。

本發(fā)明所述高啟動(dòng)強(qiáng)度寬宿主范圍組成型表達(dá)質(zhì)粒，命名為pMMPc，由復(fù)制子Ref1010、篩選標(biāo)記基因bla(氨芐抗性基因)、多克隆位點(diǎn)、基因間序列和高啟動(dòng)強(qiáng)度組成型啟動(dòng)子Pc組成；其特征在于，所述質(zhì)粒pMMPc的核苷酸序列如SEQ?ID?No.4所示；其中，所述高啟動(dòng)強(qiáng)度組成型啟動(dòng)子Pc的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。

本發(fā)明所述的質(zhì)粒pMMPc的構(gòu)建方法是：

合成啟動(dòng)子Pc，共225bp。

以上述合成的Pc片段為模板，設(shè)計(jì)引物如下：

Pc.f(劃線部分為MluI酶切位點(diǎn))CATGACGCGTTGCCGATACAAGAACAA

Pc.r(劃線部分為EcoRI酶切位點(diǎn))GTCAGAATTCACGGGTTCGCTACCTGC

然后配制反應(yīng)體系：ddH₂O?34μl，dNTP?Mixture(2.5mM?each)4μl，10×Easy?Taq?Buffer5μl，Sense?Primer(20μM)0.5μl，Anti?Primer(20μM)0.5μl，模板DNA(合成的啟動(dòng)子Pc片段)0.5μl，EasyTaq?1μl。

體系配好以后進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，循環(huán)如下：

94℃4min；之后94℃30s，55℃30s，72℃30s，共29個(gè)循環(huán)；最后72℃10min。

分別用相應(yīng)的核酸內(nèi)切酶對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物和寬宿主范圍表達(dá)質(zhì)粒pMMB66EH(核苷酸序列如SEQ?ID?No.3所示)進(jìn)行酶切，DNA連接酶連接，進(jìn)行鑒定，獲得陽(yáng)性重組質(zhì)粒，命名為pMMPc；所述質(zhì)粒pMMPc的核苷酸序列，如SEQ?ID?No.4所示。

本發(fā)明所述質(zhì)粒pMMPc在革蘭氏陰性菌中表達(dá)兒茶酚雙加氧酶的應(yīng)用。其中，所述兒茶酚雙加氧酶的表達(dá)是以在質(zhì)粒pMMPc啟動(dòng)子Pc后插入兒茶酚雙加氧酶的基因bphC(核苷酸序列如SEQ?ID?No.2所示)實(shí)現(xiàn)。