[發明專利]一種大豆北方莖潰瘍病菌活性檢測方法

有效

• 申請號: 201010277268.1
• 申請日: 2010-09-09
• 公開（公告）號: CN102401792A
• 公開（公告）日: 2012-04-04
• 發明（設計）人: 章桂明;王穎;程穎慧;向才玉;馮建軍
• 申請（專利權）人: 深圳出入境檢驗檢疫局動植物檢驗檢疫技術中心
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N1/30;C12Q1/04
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產權代理有限公司 44281
• 代理人: 羅瑤

技術領域

本發明涉及一種微生物活性檢測方法，特別是涉及一種大豆北方莖潰瘍病菌(Diaporthe?phaseolorum(Cooke?et?Ell)Sacc.var.caulivora?Athow?&?Caldwell，DPC)的活性檢測方法。

背景技術

大豆北方莖潰瘍病菌(Diaporthe?phaseolorum(Cooke?et?Ell)Sacc.var.caulivora?Athow?&?Caldwell，DPC)是嚴重危害大豆生產的一種種傳病原真菌，屬子囊菌門、子囊菌綱、間座殼目、黑腐皮殼科、間座殼屬，無性階段為擬莖點霉屬。

大豆北方莖潰瘍病菌能侵染大豆植株的各個生長階段，植株受侵染的莖組織部位易碎，表皮剝落，形成環形帶的環狀損傷，嚴重時導致植株死亡。受侵染的種子皺縮，變輕，外表白堊狀。發病嚴重的田塊有80％的植株受到侵染，產量損失高達50％，造成嚴重的經濟損失。該菌主要以帶病植物殘體及種子進行遠距離傳播，種子帶菌率達10％-20％。近年來該病害發展迅速，在美國、加拿大、阿根廷(Pioli?et?al.，2003)、厄瓜多爾、巴西(Costamilan?et?al.，2008)、保加利亞、克羅地亞、塞爾維亞、黑山、法國、意大利、俄羅斯、西班牙、韓國等國家及地區有發生報道，是國外大豆生產上的重要真菌病害。

病原菌活性檢測是檢驗檢疫的一項重要任務，對正確的評價有害生物的入侵風險具有重要意義。為了研究準確、靈敏、快速的檢測方法，對大豆北方莖潰瘍病菌的檢測研究主要集中于分子生物學方面，這類方法如PCR等，能夠提高檢測效率，但是不能反映病原菌的活性情況。目前，大豆北方莖潰瘍病菌活性檢測依賴于傳統的形態學鑒定方法，該方法因為需要通過10天左右的保濕培養，然后對培養物進行形態學鑒定，所以在進行病原菌形態學鑒定的同時也確定了其活性，因此，真正意義上的單獨對大豆北方莖潰瘍病菌的活性研究尚未有報道。雖然，通過形態學鑒定能夠準確、可靠的檢測出大豆北方莖潰瘍病菌的活性，但是該方法耗時長，不能很好的滿足實際檢驗檢疫工作的需要。

發明內容

本發明的目的是針對上述大豆北方莖潰瘍病菌活性檢測時間長的問題，提供一種新的簡便、快速的大豆北方莖潰瘍病菌活性檢測方法。

為了實現上述目的，本發明采用了以下技術方案：

本發明公開了一種大豆北方莖潰瘍病菌活性檢測方法，該方法采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察經過熒光染料染色的大豆北方莖潰瘍病菌孢子，優選的染料為碘化丙啶。

所述活性檢測方法中碘化丙啶的染色終濃度為0.05μmol/L-2μmol/L，優選染色濃度為0.05μmol/L-0.06μmol/L。

所述碘化丙啶染料的染色時間為15min-30min，優選為15min，且染色過程于室溫避光條件下進行。

由于采用以上技術方案，本發明的有益效果在于：

本發明的活性檢測方法能夠有效的區分大豆北方莖潰瘍病菌孢子的死活，從制樣到檢測完成僅需要30分鐘，可以直接對單個孢子的染色情況進行死活判斷。本發明具有快速、準確、靈敏、重復性好等特點，有望替代傳統的通過形態學檢測活性的方法，適合于口岸檢驗檢疫、農業生產、植物保護等部門使用。

附圖說明

圖1為本發明一種實施例的大豆北方莖潰瘍病菌單個孢子活性檢測圖，圖中A和B為活孢子的掃描結果圖，A為激光掃描通道下的掃描結果，孢子內部沒有熒光，B為明場通道下的掃描結果，C和D為死孢子的掃描結果圖，C為激光掃描通道下的掃描結果，孢子內部顯示紅色熒光，D為明場通道下的掃描結果。

具體實施方式

本發明公開了一種大豆北方莖潰瘍病菌活性檢測方法，包括如下步驟：

(1)孢子懸浮液配制；用滅菌去離子水配置大豆北方莖潰瘍病菌孢子懸浮液，收集于1.5mL離心管中，振蕩混勻，10000rpm離心1min，棄上清收集孢子；再加入1mL滅菌去離子水洗滌孢子，10000rpm離心1min，棄上清，最后加入1mL滅菌去離子水重懸，獲得孢子懸浮液，濃度約為105-106個/mL。

(3)孢子染色處理；采用染料對孢子懸浮液進行染色，優選的染料為碘化丙啶，染色條件為，室溫下避光染色15min-30min，優選15min；離心移棄含有染料的上清液，終止染色，滅菌蒸餾水洗滌兩次，重懸孢子，制片。所用染料碘化丙啶與孢子懸浮液混合后，碘化丙啶在混合液中的適合染色終濃度應在0.05μmol/L-2μmol/L，優選染色濃度為0.05μmol/L-0.06μmol/L。