[發(fā)明專(zhuān)利]一種用于檢測(cè)轉(zhuǎn)基因大豆的鎖式探針及檢測(cè)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010277206.0
• 申請(qǐng)日: 2010-09-09
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102399853A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-04-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 章桂明;向才玉;繆建錕;程穎慧
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 深圳出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/68
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 深圳鼎合誠(chéng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44281
• 代理人: 羅瑤

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)，特別是涉及一種基于鎖式探針的滾環(huán)擴(kuò)增與基因芯片相結(jié)合的轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

1983年第一例轉(zhuǎn)基因作物(Genetically?Modified?Organism，GMO)面世，標(biāo)志著人類(lèi)利用基因工程技術(shù)改良作物的開(kāi)始。轉(zhuǎn)基因作物在抗蟲(chóng)、抗病害、抗除草劑及品質(zhì)改良方面較常規(guī)育種周期更短，更具備優(yōu)勢(shì)，產(chǎn)生巨大的經(jīng)濟(jì)效益，商業(yè)種植面積迅速增加。隨著轉(zhuǎn)基因作物的在全球內(nèi)種植比例不斷升高，其安全性也受到廣泛關(guān)注。各國(guó)都對(duì)轉(zhuǎn)基因作物在環(huán)境安全、對(duì)人體健康影響、標(biāo)簽貼示及知識(shí)產(chǎn)權(quán)方面給予重視。轉(zhuǎn)基因大豆在轉(zhuǎn)基因作物中種植面積最廣，而Round?up?ready(RRS)在轉(zhuǎn)基因大豆中所占比例最高。

國(guó)內(nèi)外研究者對(duì)轉(zhuǎn)基因大豆Round?up?ready的檢測(cè)方法都進(jìn)行了大量的研究，主要采用多重PCR，多重實(shí)時(shí)熒光PCR、PCR-基因芯片等檢測(cè)方法。傳統(tǒng)的多重常規(guī)PCR檢測(cè)方法在平臺(tái)擴(kuò)展方法具有一定的局限性，隨著待檢目標(biāo)的增加，需要對(duì)體系中的每套引物的用量及比例重新進(jìn)行優(yōu)化，并且兼顧擴(kuò)增效率等因素，工作量較大。而多重實(shí)時(shí)熒光PCR雖然在檢測(cè)靈敏度等方面較多重常規(guī)PCR檢測(cè)方法有優(yōu)勢(shì)，但是由于目前儀器自身及熒光染料研制的限制，僅能同時(shí)提供互不干擾的4個(gè)熒光通道，也限制了該技術(shù)在檢測(cè)通量擴(kuò)展。常規(guī)的多套PCR-基因芯片檢測(cè)方法，需要多套引物進(jìn)行擴(kuò)增，操作步驟繁瑣，并不適合大規(guī)模的高通量檢測(cè)。

1994年Nilsson在《Science》雜志報(bào)道的Padlock?Probe(簡(jiǎn)稱(chēng)PLP，中文譯名鎖式探針)，給多重檢測(cè)方法提供新的選擇，帶來(lái)了革命性的改變(Nilsson?et?al.，1994)。鎖式探針是長(zhǎng)約55-130個(gè)堿基的單鏈DNA。PLP主要由5部分組成：特異性5’端檢測(cè)區(qū)T1(5’帶有PO4基團(tuán))、通用擴(kuò)增引物P1、通用擴(kuò)增引物P2、特異性標(biāo)簽(Zip)、特異性3’端檢測(cè)區(qū)T2。在滾環(huán)擴(kuò)增中利用一對(duì)通用引物可以實(shí)現(xiàn)對(duì)多條探針的同時(shí)擴(kuò)增，并且通過(guò)固定在基因芯片上的與鎖式探針中Zip標(biāo)簽互補(bǔ)的cZip對(duì)滾環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雜交及信號(hào)分析，該方法對(duì)多重目標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)只需更換其中的檢測(cè)臂區(qū)和Zip標(biāo)簽，完全避免了多重PCR檢測(cè)的每條引物濃度比例等優(yōu)化調(diào)節(jié)，并且降低了引物之間的互相競(jìng)爭(zhēng)，使基因芯片檢測(cè)不再受到常規(guī)多重PCR的限制，實(shí)現(xiàn)了真正意義的高通量檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是針對(duì)目前轉(zhuǎn)基因大豆多靶標(biāo)檢測(cè)中存在的問(wèn)題，提供一種特異性好的鎖式探針。

本發(fā)明的另一目的是針對(duì)上述問(wèn)題，提供一種基于上述鎖式探針的操作簡(jiǎn)便、擴(kuò)展性能好、靈敏、可靠的轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：

本發(fā)明公開(kāi)了一種用于轉(zhuǎn)基因大豆檢測(cè)的鎖式探針，所述探針的序列從5’端到3’端依次包括T1、P1、P2、Zip、T2區(qū)段，所述T1和T2為與檢測(cè)目標(biāo)序列匹配的檢測(cè)區(qū)域，P1和P2為通用引物結(jié)合區(qū)域，Zip為特異性標(biāo)簽，

所述T1含有Seq?ID?No.1所示序列，T2含有Seq?ID?No.2所示序列；

或者T1含有Seq?ID?No.3所示序列，T2含有Seq?ID?No.4所示序列；

或者T1含有Seq?ID?No.5所示序列，T2含有Seq?ID?No.6所示序列；

或者T1含有Seq?ID?No.7所示序列，T2含有Seq?ID?No.8所示序列；

Seq?ID?No.1：5’-CGTTGAAGATGCCTCTGCCGACAGTG-3’

Seq?ID?No.2：5’-GATAAAGGAAAGGCCAT-3’

Seq?ID?No.3：5’-TTGCCGGTCTTGCGATGATTATCATATAA-3’

Seq?ID?No.4：5’-TTCTTAAGATTGAATCCTG-3’

Seq?ID?No.5：5’-GGCACAAGGGATACAAACCCTTAATCC-3’

Seq?ID?No.6：5’-TGGCACAAATTAACAACAT-3’

Seq?ID?No.7：5’-TTTGGGTTCCCTATGTTTATTTTAACCTGTATGTATG-3’

Seq?ID?No.8：5’-CCACCTTCCTTTTCCA-3’。

所述鎖式探針的Zip區(qū)段選自Seq?ID?No.9-12所示序列中的一條序列；