[發明專利]一種利用實驗室飼養的蜜蜂幼蟲培養蜜蜂球囊菌的方法

無效

• 申請號: 201010276775.3
• 申請日: 2010-09-09
• 公開（公告）號: CN101946752A
• 公開（公告）日: 2011-01-19
• 發明（設計）人: 李江紅;鄭志陽;梁勤;陳大福
• 申請（專利權）人: 福建農林大學
• 主分類號: A01K67/033
• 分類號: A01K67/033;C12N1/14
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學俊

技術領域

本發明涉及了一種培養蜜蜂球囊菌的方法，更具體地涉及了一種利用實驗室飼養的蜜蜂幼蟲培養蜜蜂球囊菌的方法。

發明背景

白堊病是一種蜜蜂真菌性疾病，它是由蜜蜂球囊菌引起的。該病原菌主要是在幼蟲期伴隨著蜜蜂的食物一起進入蜜蜂幼蟲的消化道內，在整個幼蟲期基本不會蜜蜂發病，只是在幼蟲發育完全之后，進入蛹期開始，菌絲迅速在蜜蜂幼蟲體內生長，充斥整個蜜蜂幼蟲體內，導致蜜蜂死亡，形成的菌絲最后突破蜜蜂的表皮，在蜜蜂體內、體外形成包囊，內含數量眾多的孢子，一般每只蜜蜂幼蟲可形成10⁹個孢子，這些孢子又可作為下一輪侵染其他蜜蜂幼蟲的病原開始新一輪的侵染過程。在自然情況下，這些蜜蜂球囊菌的孢子可以存活幾十年，蜂群內蜜蜂個體之間存在著非常密切的交互哺育的生物學特性，哺育蜂飼喂蜜蜂的幼蟲，成年蜜蜂之間的相互飼喂等等，蜜蜂球囊菌孢子伴隨這一過程迅速在蜂群內所有的蜜蜂個體內傳播。在一個蜂場內不同的蜂群之間因蜂農常規的蜂群管理措施以及蜜蜂的謎巢等行為導致蜜蜂球囊菌孢子在不同的蜂群之間傳播。同時，又因蜜蜂的轉地放蜂等養蜂生產活動，可促進蜜蜂白堊病在更大的地域范圍內傳播和流行。雖然蜜蜂球囊菌對成年蜜蜂的危害不大，但球囊菌的孢子通過飼料和成年蜜蜂哺育喂食蜜蜂幼蟲時傳染給蜜蜂幼蟲，嚴重危害時，導致蜜蜂幼蟲的大量死亡，使得蜂群不能夠發展壯大，其生產蜂產品的能力和在農業中的授粉效能無法發揮，給養蜂業打來沉重的打擊。

鑒于此，過去數十年來，為應對蜜蜂球囊菌的危害，科技工作者和蜂農開展多種多樣的防治工作，世界范圍內，包括一些改善了的養蜂管理措施、多種多樣的化學藥物、植物源抑菌劑的開發利用、新型抗生素等等方法應用于蜜蜂球囊菌的防治，但由于種種原因，至今還沒有有效防控蜜蜂白堊病危害的技術與方法。因此，業界還需加大科研的力度，探究蜜蜂球囊菌流行和侵染蜜蜂的途徑，尋找其致病過程中可以利用的環節，開發可以有效控制球囊菌生長的技術和方法。

為研究蜜蜂球囊菌及其侵染蜜蜂的過程和途徑，球囊菌的培養是必不可少的一項工作。過去的養蜂和研究實踐中，已經開發形成了一些可以有效培養蜜蜂球囊菌的方法。比如，自然情況下，球囊菌就可以侵染蜜蜂，我們可以從蜂群中收集染病的蜜蜂幼蟲及生長的球囊菌，但這種培養的球囊菌是以飼養的蜂群為對象，我們無法控制蜜蜂幼蟲是否攝入、哪個日齡的蜜蜂攝入以及攝入球囊菌孢子的數量等等，受多種不可控條件的制約。因此蜂群內球囊菌的感染和生長過程無法控制，給相關的研究帶來困難。

針對蜜蜂球囊菌生長的特點，目前已經有利用培養基進行體外培養的技術與方法（Appl.?Envir.?Microbiol.,?Jul?1987;?53:?1679?–?1684;?），為蜜蜂球囊菌相關生物學的研究做了很多工作。但這些體外的球囊菌培養方法與其在蜜蜂體內的生長情況還是不一樣的。由于培養基質的不同，球囊菌的生長特性是不一樣的。尤其對于研究工作來講，需要了解球囊菌在蜜蜂體內萌發、生長和侵染的各個環節，一般蜂群接種培養的方法對球囊菌的進入蜜蜂體內的時間和進程無法控制，而利用各種培養基進行培養的方式不是在蜜蜂體內，不能代表侵染蜜蜂的生理過程，因而都不能滿足工作的需要。

發明內容

為了解決上述問題，本發明提供了一種利用實驗室飼養的蜜蜂幼蟲培養蜜蜂球囊菌的方法，具有重要的科學意義。

本發明利用實驗室飼養的蜜蜂幼蟲培養蜜蜂球囊菌的方法，包括以下步驟：

（1）蜜蜂幼蟲的實驗室飼養：

利用24孔板來飼喂蜜蜂的幼蟲直至蜜蜂幼蟲發育完全；培養箱培育條件溫度為34.5℃，濕度≥80%；化蛹后，用濾紙吸干體表的飼料后，置入墊有濾紙的24孔板內完成蛹期的發育；

（2）接種孢子的準備：

接種用的孢子來自于患病蜂群的染病幼蟲，采集這些形成孢子的染病幼蟲，用勻漿器磨碎幼蟲，移至加有滅菌水的燒杯內，加玻璃珠，攪拌4小時以上，制備成接種用的孢子母液；

（3）接種：

將準備好的孢子母液加入調配好的蜜蜂幼蟲的飼料內，使孢子終濃度為10⁴-10⁶個/毫升；接種的對象為第3-5日齡的蜜蜂幼蟲；接種方法為：在給第3-5日齡的蜜蜂幼蟲更換飼料時，將混有孢子的飼料飼喂蜜蜂24?小時，隨后就轉為正常的沒有孢子的飼料飼喂；

（4）低溫處理：

接種時采用30℃處理4個小時的低溫處理，之后轉入正常的培養箱內進行飼養。