[發明專利]基于光纖倏逝場照明器的光激活定位顯微成像系統

無效

• 申請號: 201010275527.7
• 申請日: 2010-09-08
• 公開（公告）號: CN101949849A
• 公開（公告）日: 2011-01-19
• 發明（設計）人: 呂曉華;曾紹群;駱清銘;黃振立;付玲
• 申請（專利權）人: 華中科技大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 唐正玉

技術領域

本發明涉及一種基于光纖倏逝場照明器的光激活定位顯微成像系統，尤其是一種可以對樣品進行多方位照明成像的光激活定位顯微成像系統。

背景技術

生物科學領域中，精確定位特定蛋白對研究蛋白的位置和功能有著重要作用。電子顯微鏡和非光學類掃描探針顯微術可以達到納米級的分辨率，但是其無法特異性標記研究單個蛋白分子，同時也無法用于觀察研究活體。

光學顯微成像可以進行無損傷性活體檢測及單分子檢測，并且可以提供偏振態、光譜等重要的光學信息，這些優點使光學顯微成像在生物研究中有著廣泛的應用。但是普通的遠場光學顯微成像由于受到阿貝的瑞利衍射極限的限制，寬場和共聚焦顯微鏡的分辨率只能達到200nm左右。由于受到有限的空間分辨率的限制，普通的遠場光學顯微成像無法用于微小結構的研究如蛋白質功能的研究等。近年來，隨著新型熒光探針的出現及成像方式的革新，光激活定位顯微技術的分辨率已經達到約20nm。

光激活定位顯微技術利用光激活蛋白的光激活特性，通過控制激活光的光強以實現視野內稀疏的光激活熒光蛋白分子被激活，然后使用成像光激發激活態的熒光蛋白發出熒光，而其他未被激活的熒光蛋白則無法發出熒光，這樣實現每個衍射限制區域內至多出現一個激活態的熒光蛋白。最后將采集到的單分子空間光強信息進行處理，計算出單分子精確的位置信息。這樣經過多次重復，直至熒光蛋白幾乎都被漂白，將所有定位信息疊加起來即可獲得突破衍射極限的超分辨成像。存在的一個重要問題是，其需要探測的是單分子的光強信息，由于單分子信號很弱，并且很容易受到背景噪聲的影響，所以一般光激活定位顯微技術利用的是全內反射產生的倏逝場進行照明。

全內反射熒光顯微術利用全內反射產生的倏逝場來照明樣品，由于倏逝場只存在于百納米級的薄層內，所以只有處于該層的熒光分子受到激發發出熒光，可以很好的抑制了背景噪聲，得到很高信噪比的熒光成像。

然而，倏逝場只存在于與樣品貼壁面100nm左右的范圍內，所以光激活定位顯微技術一般只能用于觀察細胞貼壁面的淺層信息，而無法觀察可能具有生物功能的細胞上表面和側面；同時為了得到較好效果倏逝場而使用的高數值孔徑的物鏡增加了系統的成本。

發明內容

本發明針對上述現有技術存在的不足，利用光纖倏逝場照明，設計了一種基于光纖倏逝場照明器的光激活定位顯微成像系統，本發明在傳統的光激活定位顯微成像系統的基礎上將照明光路和成像光路分離開，簡化了光路；利用光纖倏逝場照明器進行照明，不需要高數值孔徑的物鏡，降低了系統成本；同時通過控制光纖倏逝場照明器的位置、深度和角度，以實現對細胞樣品各表面進行成像。

本發明技術方案為：

基于光纖倏逝場照明器的光激活定位顯微成像系統，主要由激活激光器11、成像激光器12、中性濾光片(9，10)、快門及其控制器(7，8)、反射鏡6、二色鏡5、透鏡4、光纖倏逝場照明器1、操控器3、倒置熒光顯微鏡14、探測器電子倍增EMCCD13組成；激活激光器11發射的激活激光依次經過中性濾光片9、快門及其控制器7、反射鏡6、二色鏡5、透鏡4入射到光纖倏逝場照明器1；成像激光器12發射的成像激光依次經過中性濾光片10、快門及其控制器8、二色鏡5、透鏡4入射到光纖倏逝場照明器1；光纖倏逝場照明器1固定在操控器3上，光纖倏逝場照明器1放置在倒置熒光顯微鏡14的樣品池內，探測器電子倍增EMCCD13采集倒置熒光顯微鏡14的物鏡收集到熒光信號。激活激光器11用于發射激活激光，中性濾光片9控制激活光的光強，快門及其控制器7用于控制激活激光的照射時間；成像激光器12用于發射成像激光，中性濾光片10用于控制成像激光的光強，快門及其控制器8用于控制成像激光的照射時間；反射鏡6用于改變激活光方向；二色鏡5能反射成像激光，而對激活激光透射，經過反射鏡6和二色鏡5的激活激光和經過二色鏡5的成像激光的光軸重合；透鏡4用于將激活激光和成像激光耦合入光纖倏逝場照明器；光纖倏逝場照明器1用于為樣品提供倏逝場照明；操控器3可以對光纖倏逝場照明器進行三維位置調節，這樣光纖倏逝場照明器的位置、深度及角度可自由變化；探測器EMCCD13用于接收倒置熒光顯微鏡14的物鏡收集到熒光信號。

所述的光纖倏逝場照明器1采用專利號為200810237414.0的“光纖倏逝場照明器”。

本發明的特點為：(1)將照明光路和成像光路分離開，簡化了系統光路；(2)不需要大數值孔徑物鏡，降低了系統成本；(3)通過控制光纖倏逝場照明器的位置對細胞各表面進行成像，并且調節方便。

附圖說明

圖1為基于光纖倏逝場照明器的光激活定位顯微成像系統的系統結構示意圖。