[發(fā)明專利]IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010275380.1
• 申請(qǐng)日: 2010-09-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101948545A
• 公開(kāi)（公告）日: 2011-01-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 唐金寶;楊洪鳴;梁淑娟;陳永
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 濰坊醫(yī)學(xué)院
• 主分類號(hào): C07K19/00
• 分類號(hào): C07K19/00;C12N15/62;C12N15/81;G01N33/535
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)專利商標(biāo)事務(wù)所有限公司 37221
• 代理人: 楊琪

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種能作為酶標(biāo)記抗體用于免疫測(cè)定的IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白，屬于生物工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

堿性磷酸酶(Alkaline?Phosphatase，AP)和辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish?Peroxidase，HRP)是酶免疫測(cè)定(enzyme-linked?immunosorbent?assay，ELISA)中較為常用的免疫標(biāo)記用酶。在ELISA中應(yīng)用，AP系統(tǒng)的敏感性一般高于應(yīng)用HRP系統(tǒng)，空白值也較低。但由于AP較難得到高純度制劑，穩(wěn)定性較HRP低，價(jià)格較HRP高，制備酶結(jié)合物時(shí)得率較HRP低等原因，因此國(guó)內(nèi)在ELISA中一般均采用HRP。

堿性磷酸酶在免疫測(cè)定中作為標(biāo)記用酶，是通過(guò)催化相應(yīng)底物顯色實(shí)現(xiàn)的。常用標(biāo)記用酶的AP有兩個(gè)來(lái)源，分別從大腸桿菌和小牛腸膜中提取，牛小腸堿性磷酸酶比活高達(dá)2000U/mg蛋白，大腸桿菌堿性磷酸酶比活40-60U/mg蛋白。大腸桿菌為原核生物而不能對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化。序列分析表明AP活性中心Asp101-Ser102-Ala103序列高度保守。糖基化可能是影響其活性的重要因素，但并未得到證實(shí)。

目前，免疫酶標(biāo)試劑制備方式是采用雙功能試劑(如戊二醛，過(guò)碘酸鹽等)將抗體與酶偶聯(lián)，按以上方法制備的結(jié)合物一般混有未結(jié)合的酶和抗體。理論上結(jié)合物中混有游離酶不影響ELISA中最后的酶活性測(cè)定，因經(jīng)過(guò)洗滌，非特異性吸附于固相上的游離酶已被洗去。但游離的抗體則會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相抗原，因而減低結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體量，故制備的結(jié)合物應(yīng)予以純化。因此，傳統(tǒng)的抗體與酶的標(biāo)記方式需要交聯(lián)、純化等多步蛋白質(zhì)操作；而且偶聯(lián)后往往存在蛋白質(zhì)活性降低，抗體-酶結(jié)合物不均一，因而降低了檢測(cè)的靈敏度。

利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)免疫測(cè)定標(biāo)記用酶，可改變從生物體分離提純的生產(chǎn)方式，也是得到符合標(biāo)記要求高純度酶的一條新途徑。而將標(biāo)記酶直接與抗體融合表達(dá)的方式制備，可克服化學(xué)交聯(lián)劑偶聯(lián)方法的弊端。

理論上盡管將堿性磷酸酶與抗體融合表達(dá)，但目前研究主要集中在單鏈抗體(ScFv)與AP融合蛋白的構(gòu)建，但是每檢測(cè)一種抗原就要制備相應(yīng)的融合抗體，在不能或不便構(gòu)建抗體-酶融合蛋白時(shí)則融合標(biāo)記受阻。因此，尋找一種可結(jié)合多種一抗的二抗并與酶以融合表達(dá)方式來(lái)制備免疫酶標(biāo)試劑具有重要意義。

IgG抗體親和肽是來(lái)自葡萄球菌蛋白A(staphylococcal?protein?A，SpA)的ZZ結(jié)構(gòu)域。SpA為金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁的單鏈多肽，分子量為42kD，能通過(guò)疏水作用結(jié)合人、兔等多種動(dòng)物IgG的Fc段，且這種結(jié)合不影響IgG的Fab段與抗原特異性結(jié)合的免疫活性，根據(jù)SpA這一特性，SpA不僅用于免疫球蛋白和單克隆抗體的純化，還被多種標(biāo)記物(HRP，AP，F(xiàn)ITC，膠體金等)偶聯(lián)標(biāo)記用于免疫測(cè)定；因SpA與IgG結(jié)合不受種屬限制，被稱為“廣泛二抗”。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的在于提供一種無(wú)需再次標(biāo)記即可用于酶免疫測(cè)定的IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白(IgG?affibody-Alkaline?Phosphatase?fusion?protein，簡(jiǎn)寫(xiě)IgG?Ab-AP)。

本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白，是IgG抗體親和肽和堿性磷酸酶構(gòu)成的融合蛋白，其一經(jīng)產(chǎn)生即具有與IgG抗體的結(jié)合活性和AP催化活性，且二者標(biāo)記比例為1∶1；該融合蛋白的酶比活力為386±82U/mg；與兔IgG抗體的親和常數(shù)Ka≌6.7×10⁷L·mol^-1。

本發(fā)明的IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白的制備方法，步驟如下：

(1)將IgG抗體親和肽基因和堿性磷酸酶基因連接，然后構(gòu)建重組載體；

(2)電轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母，選取重組載體整合到酵母基因組上的菌株；

(3)經(jīng)G418抗性壓力篩選高拷貝表達(dá)菌株；

(4)培養(yǎng)菌株，誘導(dǎo)表達(dá)IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白；

(5)提取純化IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白。

具體如下：