[發(fā)明專利]一種生物人工肝用肝細胞的保存液及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010273403.5
• 申請日: 2010-09-06
• 公開（公告）號: CN101919381A
• 公開（公告）日: 2010-12-22
• 發(fā)明（設計）人: 高毅;秦佳升;潘明新;徐小平;蔣澤生;張志
• 申請（專利權）人: 南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 北京市立方律師事務所 11330
• 代理人: 閔磊;喬建聰

技術領域

本發(fā)明涉及人體或動物的器官、組織或細胞的體外保存液生物技術領域，尤其是涉及一種生物人工肝用肝細胞的保存液及其制備方法。

背景技術

我國是肝病的高發(fā)區(qū)，每年發(fā)生急性病毒性肝炎約120萬例，重型肝炎約占其中的0.2％～0.4％，病死率可高達70％。乙肝患者中約有1％可發(fā)展為急性或亞急性肝衰竭。約有20％急性乙肝患者可轉化為慢性，約3％患者可發(fā)展為肝炎后肝硬化。丙肝患者中約60％～80％轉化為慢性，20％可發(fā)展為肝硬化，12％發(fā)展為終末期肝病。每年死于肝病者約30萬例，其中50％為原發(fā)性肝細胞癌，大多與乙、丙型肝炎有關。因此重型肝炎、肝衰竭以及肝炎終末期肝病肝硬化和肝癌等是我國肝病患者死亡的主要原因。肝移植是治療此類疾病的最徹底與有效的方法。我國的肝移植數每年在700例以上，1年生存率超過50％，最長存活時間超過6年。但是我國重型肝炎患者多供器官缺乏，許多患者得不到及時的肝移植手術而喪失存活機會，同時有效的供體資源也未能充分利用。因此生物人工肝與肝細胞移植等細胞水平的新治療方法得到了研究與發(fā)展。肝細胞移植和生物人工肝支持在大量動物實驗和一些臨床實驗中獲得良好效果，成為有前途的肝病治療途徑。實際上，如果肝細胞移植及生物人工肝在臨床的大量運用，肝細胞的需求量必將增加，同器官移植一樣面對的供者不足的情況也將要出現。若有一實用可靠的低溫儲存技術，建立一個肝細胞庫，危重患者隨時都能得到大量高活率、有功能的肝細胞；肝細胞移植和生物人工肝技術就能普遍推廣。

生物人工肝支持系統中最重要的部件就是生物反應器。然而生物反應器的合成需要一個有豐富經驗的團隊在無菌條件下用特殊設備進行細胞的擴增及功能的標準化檢測，這就需要一個中心--“細胞工廠”去提供生物反應器裝載細胞的擴增及運送到有需要的醫(yī)院。豬肝細胞作為生物反應器裝載細胞經深低溫凍存-復蘇后細胞存活率及肝細胞特有功能均明顯下降，大大限制了人工肝的治療效果。因此，肝細胞擴增完成后，在短時間保存及長距離運輸過程中需要有一種方便、有效、實用的保護裝載細胞活力及功能的方法。4℃是器官及大規(guī)模細胞群的標準保存溫度，在此溫度下運輸無須特殊設備即可達到要求。在4℃保存過程中肝細胞損傷主要是低溫損傷及復溫再損傷，類似于器官移植過程中的缺血再灌注損傷。Belzer等根據低溫下器官的各種病理生理特點，提出了一種有效的器官低溫保護液的成分，必須具備以下五個方面的特點：①減少因低溫導致的細胞水腫②防止細胞的酸化作用③防止灌洗過程中的細胞間隙的腫脹④防止氧自由基的損傷，尤其在再灌注過程中⑤提供再生高能磷酸化合物的底物⑥保持細胞內環(huán)境穩(wěn)定。

目前市場上主要的器官保護液主要有美國設計的UW液和歐洲設計的HTK液。UW液是目前世界范圍內應用最為廣泛的一種多器官灌注保存液，能夠有效地保存腎臟72h、胰腺72h、肝臟30h、心臟24h，但是它仍然有許多不足，它的高滲性引起細胞皺縮、高粘滯性影響原位灌注、高鉀不符合生理、缺乏保護肝臟低溫保存的藥物、價格昂貴。HTK液與UW液一樣是較理想的的器官保存液，HTK液最大的優(yōu)點在于它的低粘滯性，可改善保存器官的微循環(huán)，提高組織氧化等，它仍有明顯的不足主要體現在器官保存時間的限制上，隨著時間的延長移植物無功能的發(fā)生率會大幅度提升。

發(fā)明內容

本發(fā)明要解決的技術問題是克服上述缺陷，提供了一種生物人工肝用肝細胞的保存液及其制備方法，此保存液可以在低溫狀態(tài)下很好保護生物人工肝用肝細胞的細胞活力及肝細胞特有功能，以滿足生物人工肝用大規(guī)模肝細胞庫的短期低溫保存及或遠距離運輸過程中肝細胞的保護。

本發(fā)明提供了一種生物人工肝用肝細胞的保存液，為超純水配制的溶液，該溶液中包含如下濃度范圍的組分：

十二水磷酸氫二鈉(Na₂HPO₄·12H₂O)??????????15-25mmol/L

二水磷酸二氫鈉(NaH₂PO₄·2H₂O)?????????????1-10mmol/L

一水枸櫞酸鉀(C₆H₅K₃O₇·H₂O)???????????????4-6mmol/L

氯化鈉(NaCl)??????????????????????????????10-30mmol/L