[發明專利]豬瘟病毒疫苗及其生產方法

無效

• 申請號: 201010273224.1
• 申請日: 2010-09-02
• 公開（公告）號: CN101926991A
• 公開（公告）日: 2010-12-29
• 發明（設計）人: 張許科;孫進忠;喬榮岑
• 申請（專利權）人: 洛陽普萊柯生物工程有限公司
• 主分類號: A61K39/187
• 分類號: A61K39/187;C12N7/08;A61P31/14;C12R1/93
• 代理公司: 北京華夏正合知識產權代理事務所(普通合伙) 11017
• 代理人: 韓登營

技術領域

本發明屬于生物制品技術領域，涉及一種豬瘟病毒疫苗及其生產方法。

背景技術

豬瘟(Classical?Swine?fever，簡稱CSF)又稱為豬霍亂(Hog?cholera)或歐洲型豬瘟(European?swine?fever)，是一種豬只急性或超急性發熱的病毒傳染性疾病，臨床上的特征是散播迅速、發燒，解剖檢驗時可看到典型的出血病變。豬瘟可感染各種年齡的豬只，一年四季流行，發病率和死亡率均高，對豬只危害極大。本病是威脅養豬業最重要的傳染病之一。世界動物衛生組織(OIE)將豬瘟列為A類16種法定傳染病之一，中國則定為一類烈性傳染病。

許多國家和地區使用豬瘟活毒疫苗強制接種免疫，也是目前防治豬瘟的最佳方法。

目前豬瘟(CSF)疫苗的生產方法有以下幾種：(1)組織苗法：即以豬瘟病毒(兔化弱毒株)接種家兔，然后收集家兔的脾臟和淋巴結生產豬瘟脾淋苗；(2)原代牛睪丸細胞苗法：即采集初生小牛睪丸，經過EDTA-胰酶消化分散細胞，用轉瓶培養系統培養，生產細胞疫苗；(3)細胞系法：用細胞系(例如ST)經過EDTA-胰酶消化分散細胞，用轉瓶培養系統培養，得到豬瘟兔化弱毒疫苗，收獲細胞病毒液，加適宜穩定劑，經冷凍真空干燥制成細胞系豬瘟活疫苗。

其中組織苗法、原代牛睪丸細胞苗法普遍存在產量不高、效率低、外源病毒污染、產毒滴度不高、批間差異大等缺點；細胞系法，雖然解決了外源病毒污染問題，產毒滴度也有很大的提高，批間差異也減小了，但疫苗產量依舊不能得到很大的提高，且工藝繁瑣、效率低下，造成很大的人員浪費。

發明內容

本發明主要目的是提供一種豬瘟疫苗的生產方法，包括如下步驟：

1)微載體生物反應器中，加入微載體、傳代細胞與細胞生長液，啟動細胞吸附程序，使微載體與傳代細胞充分結合后，啟動細胞培養程序，培養傳代細胞。其中微載體密度為30～60g/L，傳代細胞密度為1.6×10⁷～3.2×10⁷cells/g微載體；

2)上述傳代細胞培養至4×10¹⁰cells/L～3.2×10¹¹cells/L時換用細胞維持液，按照感染復數為M.O.I.＝0.01～1接種豬瘟病毒，啟動病毒吸附程序，使病毒與傳代細胞充分接觸，換用病毒培養程序，擴增豬瘟病毒；

3)病毒培養2～5天后，收獲病毒液，獲得豬瘟病毒，4℃保存；

4)收獲的病毒液，純化后加入凍干保護劑，制得豬瘟疫苗。

優選地，本發明所述的生物反應器為微載體懸浮培養生物反應器。

優選地，本發明所述的生物反應器為為潮汐式微載體懸浮培養生物反應器。

優選地，本發明所述的微載體為球形、網狀或片狀

優選地，本發明所述的微載體的成分為聚酯、明膠或多糖。

優選地，本發明所述的步驟1)中所述細胞生長液為含羊血清或牛血清的DMEM培養基。

優選地，本發明所述的步驟2)中所述細胞維持液為含羊血清或牛血清的DMEM培養基。

優選地，本發明所述的步驟1)中所述細胞生長液為含3％～15％羊血清或牛血清的DMEM培養基。

優選地，本發明所述的步驟2)中所述細胞維持液為含1％～5％羊血清或牛血清的DMEM培養基

優選地，本發明所述微載體生物反應器的培養條件為溫度34℃～37℃，CO₂濃度為2.5％～5％，培養液pH值為7.0～7.6。

優選地，本發明所述的步驟1)中所述的細胞貼附程序為：細胞貼附程序為：up?2000～3000ml/min；hold?1min；Down?2000～3000ml/min；hold?30s；細胞培養程序為：up?1000～3000ml/min；hold?1min；Down?1000～3000ml/min；hold?1min；步驟2)所述的病毒吸附程序為：up?1000～3000ml/min；hold?1min；Down?1000～3000ml/min；hold?30s；病毒培養程序參數為：up?1000～2000ml/min；hold?1min；Down：1000～2000ml/min；hold?1min。