[發明專利]一種α-酮異己酸含量的檢測方法

無效

• 申請號: 201010272932.3
• 申請日: 2010-09-06
• 公開（公告）號: CN101975827A
• 公開（公告）日: 2011-02-16
• 發明（設計）人: 陳堅;堵國成;李江華;劉龍;祝玉紅
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 北京匯信合知識產權代理有限公司 11335
• 代理人: 王秀麗

技術領域

本發明涉及一種α-酮異己酸含量的檢測方法，尤其是一種利用高效液相色譜的檢測方法，屬于分析技術領域。

背景技術

α-酮異己酸(KIC)，又稱α-氧代異戊酸，是支鏈氨基酸—亮氨酸的中間代謝產物，是一類在生物體內擁有重要作用的支鏈α-酮酸，是重要的有機合成、藥物合成及生物合成中間體，在醫藥、食品、飼料等行業有著重要的應用前景。KIC能夠抑制胰高血糖素的分泌，促進胰島素的分泌，具有促進肌肉蛋白合成，防止肌肉分解的雙重作用。KIC與骨骼肌的合成代謝有密切的關系，它可以減少肌肉組織的分解，加速肌肉的合成，可以為骨骼肌在訓練和比賽時直接提供能量，減緩運動對肌肉的損傷程度，是一種重要的運動營養成份和營養增補劑。α-酮異己酸是兩個羧基直接相鄰的酮酸，含有氨基酸的碳結構骨架，因其反應中心多而顯出其重要和特殊的化學性質，在很多有機合成及生物代謝過程中起著承上啟下的中間體的作用，所以近年來KIC的合成已成為熱點。

目前檢測酮酸含量的方法主要有酶偶聯法、分光光度法和高效液相色譜法。酶偶聯法的成本較高，而且一個樣品只能測定一種成分，造成時間和樣品的消耗比較多。分光光度法操作繁瑣，樣品處理中損失較多，且檢出限較高，重復性差。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種α-酮異己酸含量的檢測方法，利用高效色譜精確，穩定的檢測α-酮異己酸含量。

為解決上述技術問題，本發明的技術方案為：

將經過將溶液經離心、過濾等一系列操作，濾除固體雜質，直至濾液澄清處理的樣品注入流動相帶入所述色譜柱中，流動相為磷酸氫二銨和甲醇的混合溶液，固定相為：，樣品分離后經紫外檢測器進行檢測；根據樣品的保留時間和光譜圖進行定性分析，根據其峰面積進行定量分析。

所述色譜柱為粒徑5μm的ZORBAX?SB-Aq色譜柱。

所述流動相磷酸氫二銨和甲醇混合溶液為0.01mol/L的，有機相的比例設定為10％～20％，無機相的比例設定為80％～90％。

所述的流動相流速為0.5～1.0mL/min，所述流動相流最佳流速為0.8mL/min。

所述色譜柱柱溫為30～40℃，最佳柱溫為35℃。

紫外檢測器所用檢測波長為200～210nm，最佳檢測波長為203nm。

主要分析步驟如下：

1、樣品預處理

取一定量的儲備溶液，適度稀釋后轉移到50mL離心管中，10000r/min離心10min，然后再用0.22um濾膜過濾后備用。

2、色譜條件

(1)色譜柱：ZORBAX?SB-Aq柱；

(2)檢測器：紫外檢測器；

(3)檢測波長：200～210nm；

(4)流動相：采用0.01mol/L的磷酸氫二銨(pH2.50)-甲醇緩沖液作為流動相，有機相的比例設定為10％～20％，無機流動相的比例設定為80％～90％，平衡色譜柱使基線平穩，該條件下保留時間適合，峰形對稱，分離度好；

(5)流速：0.5～1.0mL/min；

(6)柱溫：30～40℃；

3、濃度計算方法

用α-酮異己酸標準品配制成一定梯度濃度的標準液，20uL體積進樣，按外標法，以峰面積和進樣濃度作線性回歸，得到線性回歸方程，利用該方程和樣品中α-酮異己酸的峰面積計算樣品號中的α-酮異己酸含量。

本發明提供的檢測方法通過線性試驗證明，在一定濃度下，α-酮異己酸回歸方程的相關系數為0.999，線性關系良好，易于準確定量，精密度實驗測得相對偏差僅為0.19％。應用本發明優化的各項參數可快速精確檢測α-酮異己酸含量，穩定性高，重現性好，可實現自動化，適于生產過程中對α-酮異己酸的質量控制。

附圖說明

圖1為α-酮異己酸標準品的高效液相色譜圖。

圖2為α-酮異己酸的標準曲線圖。

具體實施方式

儀器與試劑：

Agilent?1200高效液相色譜儀(HPLC)，配備G1322A型脫氣儀，G1311A型四元泵，A1329A型自動進樣器，G1316A型柱溫箱，G1315D型DAD檢測器；ZORBAX?SB-Aq色譜柱(4.6×250mm，5μm)CR22GⅡ高速冷凍離心機；AL204電子天平；FE20型梅特勒-托利多酸度計；日本島津UV-2450型紫外可見分光光度計；Pure?X制水機。