[發明專利]胡楊PeNHX1/3/6基因功能分析與利用

無效

• 申請號: 201010272649.0
• 申請日: 2010-09-06
• 公開（公告）號: CN102382841A
• 公開（公告）日: 2012-03-21
• 發明（設計）人: 夏新莉;尹偉倫;呂馥齡
• 申請（專利權）人: 夏新莉;尹偉倫;呂馥齡
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C07K14/415;C12N15/63;C12N5/10;A01H5/00
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技術領域

本發明涉及來自胡楊(Populus?euphratica?Olive)的PeNHX1/3/6基因功能的分析及其利用。

技術背景

胡楊(Populus?euphratica?Olive)是唯一能在干旱鹽堿和溫差劇烈變化的干旱沙漠地區生長的喬木建群樹種。作為天然的抗逆性極強的典型植物，胡楊已引起國際學術界的重視。研究、開發和利用胡楊抗逆性基因資源，對于深入林木抗逆性機理以及定向培育抗逆林木新品種具有重要的價值。而Na⁺/H⁺逆向轉運蛋白(Na⁺/H⁺?exchanger，NHX)在耐鹽中起到重要作用，它的功能不僅僅是解除Na⁺的毒性，在細胞器的發生及離子均衡過程中還執行體積和滲透調節的功能，是保持細胞離子均衡的關鍵因子。研究表明，NHXs在植物逆境脅迫及信號傳導過程中起到重要作用。

發明內容

本發明的目的是提供胡楊中的一種與逆境相關的NHX基因，該基因在抗鹽反應中具有重要作用。本發明所提供的NHX基因來源于胡楊，是NHX基因家族中的，為PeNHX1/3/6。

序列表中序列氨基酸殘基序列分別是由528/545/533個氨基酸殘基組成的蛋白質。

逆境相關基因PeNHX1/3/6是下列核苷酸序列之一：

1)序列表中序列1的DNA序列。

2)與序列中序列1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的DNA序列。

本發明所提供的逆境相關基因PeNHX1/3/6，使用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的表達載體(包括雙元農桿菌載體以及用于單子葉植物微彈轟擊的載體)轉化植株，可獲得對高鹽脅迫抗性增強的轉基因植株。本發明的基因在構建到植物表達載體中時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種強啟動子或誘導型啟動子。本發明的基因在構建到植物表達載體中時，可以使用增強子，但是必須與編碼序列的閱讀框相同，要保證整個序列的翻譯。

為了便于對轉基因植物細胞或植株進行鑒定及篩選，可以在構建載體時對載體進行加工，例如加入可選擇性標記，通常使用的可選擇性標記可以是編碼對抗生素(包括慶大霉素、卡那霉素、潮霉素)抗性酶的基因，也可以是GUS、GFP等可以產生顏色變化的酶或發光化合物的基因等。

攜帶有本發明的逆境相關基因PeNHX1/3/6基因的表達載體可以通過多種方法轉化植物宿主，以培育抗鹽的植物品種，例如Ti質粒、Ri質粒、電穿孔、微注射、植物病毒載體、直接DNA轉化或植物病毒載體等，所轉化的植物宿主可以是單子葉植物也可以是雙子葉植物。

下面結合具體實施例對本發明做進一步說明：

附圖說明

無

具體實施方式

實施例1，胡楊總RNA的提取

用CTAB(薩姆布魯克，分子克隆實驗指南，第三版)的方法從高鹽處理的胡楊中提取總RNA。

實施例2，胡楊PeNHX1/3/6?cDNA序列的克隆

總RNA用逆轉錄酶反轉錄合成cDNA，然后分別用引物PeNHX1：5′-ATGAATTTCGGTTTGAGGATG-3′和5′-TTCGGTTTGAGGATGGTAT-3′；PeNHX3：5′-ATGGAAGCTTATATGAGTTCAATTG-3′和5′-ACTATGCTGGGCGTGCTAA-3′；PeNHX6：5′-ATGTCGACTGTAGTAGAGGAA-3′和5′-TAGTTGTGTTGACGGTGCTT-3′對該cDNA進行PCR。PCR程序為：(1)94℃，變性5分鐘。(2)PCR擴增，35個循環：94℃，變性45秒；56℃退火45秒；72℃，延伸78秒。(3)72℃，延伸10分鐘。將PCR產物用瓊脂糖進行電泳分離，然后用天根的瓊脂糖DNA分離試劑盒回收目的片斷并與TaKaRa公司的pMD18載體進行連接，連接的反應體系為：目的片斷4μl，1μl?pMD18vector，5μl?Solution?Ⅰ，于16℃過夜連接，再將連接產物轉化進感受態的大腸桿菌Top10，用PCR的方法檢測陽性菌株，最后取轉化成功的菌株在上海生工進行DNA序列測定。