[發明專利]巣式PCR法擴增EGFR基因外顯子19片段的方法無效

申請號：	201010271634.2	申請日：	2010-09-03
公開（公告）號：	CN101988124A	公開（公告）日：	2011-03-23
發明（設計）人：	蔡燕燕;吳奇涵;顧海英	申請（專利權）人：	華東師范大學
主分類號：	C12Q1/68	分類號：	C12Q1/68
代理公司：	上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227	代理人：	吳瑾諭
地址：	200062 上***	國省代碼：	上海;31
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摘要：
搜索關鍵詞：	巣式 pcr 擴增 egfr 基因外顯子 19 片段方法
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【說明書】：

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，具體為巣式PCR法擴增DNA的技術，尤其是用巣式PCR法擴增中EGFR基因外顯子19片段的方法。

背景技術

腫瘤，特別是惡性腫瘤對人類產生的危害日益增大，目前臨床上對癌癥尚無十分有效的治療方案。這除了與腫瘤本身的特性有關外，腫瘤診斷學也存在一些不足之處，如腫瘤早期診斷效率低，確診時已發展到晚期的概率高；另外癌組織活檢也極大的增加了病人的痛苦；對于一些缺乏可靠診斷方法的實體瘤，就更不大可能取腫瘤組織進行化驗，故急需尋找新型腫瘤標記物以客服實體腫瘤取材困難并指導個性化用藥等問題。

循環DNA（circulating?DNA）是指存在于血液（血漿或血清）、滑膜液、腦脊液等體液中的細胞外DNA。對其來源，現在還未有一致的定論，但越來越多的研究顯示循環DNA來自腫瘤細胞。因此對血漿DNA作為一種新型的腫瘤臨床標記物的研究備受關注。

表皮生長因子受體（EGFR）在細胞生理過程中發揮著重要作用。吉非替尼（Gefitinib）是表皮生長因子受體的特異性靶向藥物，能夠通過抑制EGFR激酶活化及阻斷受體下游的信號轉導，從而影響腫瘤細胞的生長，吉非替尼已被用于如肺癌、胃癌、乳腺癌等癌癥的臨床治療中。2004年6月，美國科學家Lynch和Paez等人發現，并不是所有的病人對該藥都達到預期的效果，研究發現該藥對EGFR編碼區基因突變型腫瘤的治療有效率可高達80%以上，而對無突變的野生型腫瘤的治療效果不盡如人意。于是推測在非小細胞癌中表皮生長因子受體EGFR酪氨酸激酶編碼區基因突變是吉非替尼湊效的一個重要條件?？梢妼GFR基因突變的檢測，可以間接實現對一些癌癥患者的個性化治療，是臨床治療達到最優結果。

迄今為止，所發現的EGFR突變多發生于外顯子19號和21號，其中外顯子19為堿基缺失突變，外顯子21為單位點突變。研究者本人前期在對血漿中EGFR基因兩個常見突變熱點片段進行常規PCR發現，以血漿DNA作模板，由于其中DNA含量少，因此比以血液或腫瘤組織基因組作模板的PCR擴增效率低，若隨即進行二次PCR，更容易出現彌散現象，從而總結模板的質量較大程度地制約了PCR的擴增效率。為了能更好的解決這一弊端，本研究采用巢式PCR實現對血漿DNA中EGFR基因外顯子19和21的擴增，提高了檢測靈敏度和特異性。

發明內容

本發明旨在提供一種利用巣式PCR法擴增EGFR基因外顯子19片段的方法。

本發明公開了一種方法，用巢式PCR法實現對血漿DNA、石蠟切片DNA等微量基因組樣本中EGFR外顯子19的擴增，便于后續突變的檢測。

其技術方案為，用巢式PCR法擴增EGFR基因外顯子19片段的方法，包括如下步驟：

（1）第一輪PCR擴增，以血漿DNA或石蠟切片DNA為模板，擴增25～35個循環，所用的引物為：

C19F：5'-TATCAGCCTTAGGTGCGG-3'，

C19R：5'-GGATGTGGAGATGAGCAGG-3'；

優選的，每種引物的濃度分別為0.1～1μM；

反應體系中包括：四種脫氧核苷酸，每一種濃度分別為100～400μM；

DNA聚合酶，濃度為；10～100U/ml；

血漿DNA或石蠟切片DNA，濃度為20～100ng/ml；

（2）?第二輪PCR擴增，以步驟（1）的第一輪PCR擴增產物為模板，擴增25～35個循環，所用的引物為：