[發明專利]基于量子點熒光檢測的酶芯片及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201010269935.1
• 申請日: 2010-09-01
• 公開（公告）號: CN102384902A
• 公開（公告）日: 2012-03-21
• 發明（設計）人: 唐芳瓊;任湘菱;楊柳青
• 申請（專利權）人: 中國科學院理化技術研究所
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;G01N21/75
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 李柏

技術領域

本發明屬于生物檢測領域，特別是涉及基于量子點熒光多酶聯合檢測的酶芯片、基于量子點熒光檢測酶反應底物的酶芯片及基于量子點熒光檢測酶活性的酶芯片及其上述酶芯片的制備方法和應用。

背景技術

在眾多的早期快速檢測手段中，生物芯片是近年來發展最為迅速并被認為最有產業化前景的一種檢測器件，它具有非常明顯的優點，集成、并行、快速檢測等等。酶芯片是生物芯片的一種，它是通過酶分子與相應底物的結合反應來進行檢測，因此具有高專一性、低費用、操作安全、便于現場測定等優點。因為人體的各種生理變化很多與酶反應相關，所以酶芯片可以用于多種疾病的檢測。

γ-谷氨酰轉移酶(GGT)、乳酸脫氫酶(LDH)和堿性磷酸酶(ALP)等酶活性檢測是血液化驗中常有的指標，具有很重要的臨床意義。例如：γ-谷氨酰轉移酶的主要功能是參與體內蛋白質代謝，且廣泛存在于人體各組織及器官中，以腎臟最為豐富，其次是胰肝等處。在膽汁淤積、炎癥等刺激下肝合成GGT增加，因此大多數肝膽疾病血清GGT活動可有不同程度的增加。酒精性肝硬化及膽汁性肝硬化時，GGT明顯升高，可達正常的5～10倍。重型肝炎、晚期肝硬化，由于微粒體破壞、酶合成減少，GGT因而下降。各種原因引起的肝內膽汁淤積、肝外膽道梗阻，GGT均明顯增高，可達400國際單位/升以上。肝癌時，由于癌細胞逆分化，類似胚胎期，此酶的生成增加，故血清GGT也呈中度或高度升高，臨床上也常把此酶作為觀察慢性肝炎伴肝硬化病人是否轉為肝癌的參考指標。乳酸脫氫酶是一種糖酵解酶，乳酸脫氫酶存在于機體所有組織細胞的胞質內，其中以腎臟含量較高。急性心肌梗塞發作后，早期血清中LDH活性升高；肝炎、急性肝細胞損傷及骨骼肌損傷時LDH都會升高。患活動性風濕性心臟病、急性病毒性心肌炎、溶血性貧血、腎壞死等病LDH也可升高。堿性磷酸酶是一種磷酸單酯酶，廣泛存在于人體組織和體液中，以骨、肝、乳腺、腸粘膜、腎，胎盤中。阻塞性黃疸、肝硬化、肝壞死，堿性磷酸酶明顯升高(肝細胞性黃疸則升高不明顯)；原發性和繼發性肝癌時堿性磷酸酶亦明顯升高，與癌組織中或癌腫周圍肝細胞合成堿性磷酸酶增加有關；其他腫瘤如乳腺癌、肺癌、卵巢癌、骨細胞瘤、骨肉瘤等，堿性磷酸酶增高時，提示可能有肝臟轉移。因此γ-谷氨酰轉移酶(GGT)、乳酸脫氫酶(LDH)、堿性磷酸酶(ALP)的單一或聯合檢測可以實現癌癥的早期診斷(S.L.Liang，D.W.Chan，Clinica?Chimica?Acta?2007，381，93-97)。

由于酶反應具有很強的專一性，酶蛋白往往較抗體、抗原或基因蛋白等易于獲得且生物活性相對穩定，酶反應的底物一般都是小分子的有機物，容易獲得、價格便宜，所以構建檢測酶類標志物的芯片將更為方便和價廉，易于促進重大疾病早期診斷的普及化和家庭化，從而提高重大疾病的治愈率。

在生物芯片的檢測中，通過熒光標記法進行檢測是常用的方法。目前，應用最為普遍的熒光物質是有機染料，在大多數情況下，由于它們的激發光譜都較窄，所以很難同時激發多種組分，而其熒光特征譜又較寬，并且分布不對稱，這給區分不同物質的熒光帶來麻煩，因此要同時檢測多種組分較為困難。有機染料最嚴重的缺陷還是光化學穩定性差，光漂白與光解使每個染料分子能夠發出的熒光光子平均數量不多，光解產物又往往會對生物體產生殺傷作用。近年來，量子點由于其特殊的光學和電學性質，已成為生化領域的研究熱點之一。與有機熒光染料相比，量子點有以下優點：(1)熒光發射比較穩定，其發光壽命可達ms級，且不易被光漂白；(2)熒光發射強度高，譜峰窄，峰形對稱；(3)發射波長隨粒徑的增大而有規律地紅移，改變粒徑就可獲得多色發光；(4)其激發譜在吸收閾值以上幾乎是連續的，有利于多波長激發。因而量子點有望取代有機染料應用于生物芯片。目前量子點已被應用于生物芯片的組裝(S.Sabella，G.Vecchio，R.Cingolani，R.Rinaldi，P.P.Pompa，Langmuir，2008，24，13266-13269)，曾有報道組裝利用熒光原理檢測蛋白激酶的酶芯片(C.B.Cohen，E.C.Dixon，S.Jeong，T.T.Nikiforov，Analytical?Biochemistry，1999，273，89-97)，但所用的熒光物質是有機染料。雖然近幾年量子點熒光檢測的報道不斷增多，但用于檢測酶類疾病標記物的研究還未見報道。

發明內容

本發明的目的在于提供基于量子點熒光檢測的酶芯片，該酶芯片可單一檢測或同時檢測兩種以上的酶活性和/或酶反應底物的濃度。