[發(fā)明專利]富含多磷酸化多肽的酪蛋白水解物和制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010269516.8
• 申請日: 2010-09-02
• 公開（公告）號: CN101948524A
• 公開（公告）日: 2011-01-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蘇榮欣;齊崴;何志敏
• 申請（專利權(quán)）人: 天津大學(xué)
• 主分類號: C07K14/47
• 分類號: C07K14/47;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C07K1/18;C12P21/06
• 代理公司: 天津市杰盈專利代理有限公司 12207
• 代理人: 王小靜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種富含多磷酸化多肽的酪蛋白水解物和制備方法，這些磷酸肽大多攜帶SerP-SerP-SerP-Glu-Glu序列片段，屬于食品生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

酪蛋白約占哺乳動物乳品中蛋白質(zhì)總量的80％，是由α_S1-酪蛋白、α_S2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白等四種磷酸化蛋白質(zhì)聚集而成的膠束大分子。當(dāng)新生兒喂食母乳后，酪蛋白膠束作為磷酸鈣膠體的運(yùn)輸者，為孩子的骨骼形成和牙齒生長提供必要的礦物質(zhì)元素。母乳在體內(nèi)消化過程中，酪蛋白將被水解為各種各樣的多肽，但它結(jié)合金屬的功能將由水解物-酪蛋白磷酸肽(CPPs)保留甚至加強(qiáng)。目前，大量實驗和臨床數(shù)據(jù)顯示，CPPs可對人體營養(yǎng)系統(tǒng)提供多種生物學(xué)功能，如抗氧化、抗齲齒、免疫調(diào)節(jié)和補(bǔ)充礦物質(zhì)元素(如鈣、鐵、鋅)。

酪蛋白磷酸肽在蛋白序列中是無活性的，只有在食品加工或體內(nèi)消化后從序列中釋放時才能發(fā)揮其各種生物學(xué)功能。迄今為止，為了制備CPPs，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、血漿酶、Lactobacillus蛋白酶和胰酶等對酪蛋白、酪蛋白酸鈉或脫脂牛乳的水解作用已被廣泛研究。然而，這些研究大多限于水解產(chǎn)物中各種磷酸肽的制備，而未區(qū)分多磷酸化多肽和單磷酸化多肽。其中，如果CPPs含有SerP-SerP-SerP-Glu-Glu序列，帶有多個磷酸化基團(tuán)，其攜帶礦物質(zhì)元素能力較強(qiáng)。

此外，多磷酸化多肽的制備還可為研究磷酸化蛋白質(zhì)組學(xué)提供很好的樣品。在蛋白質(zhì)組學(xué)中，微量的磷酸化蛋白序列鑒定與結(jié)構(gòu)分析仍存在巨大挑戰(zhàn)。蛋白質(zhì)的可逆磷酸化是最常見且最重要的翻譯后修飾之一，幾乎參與了生命活動的所有過程，包括細(xì)胞的增殖、發(fā)育和分化、肌肉收縮、新陳代謝等。此外，許多糖尿病、老年癡呆等疑難疾病的發(fā)生，也與蛋白質(zhì)的可逆磷酸化密切相關(guān)。利用規(guī)模制備好的多磷酸多肽，可較好地解析磷酸化(尤其是多個磷酸化)對蛋白質(zhì)質(zhì)譜行為的影響規(guī)律。

目前，研究者報道了酪蛋白磷酸肽的分離純化，但有些未能對其序列結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析，有些是制備各種類型磷酸肽。為了制備多磷酸化的CPPs，需整合多種分離方式，并對最終產(chǎn)品進(jìn)行測定。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種富含多磷酸化多肽的酪蛋白水解物和制備方法。根據(jù)多磷酸化多肽的結(jié)構(gòu)特點。多磷酸化CPPs分子量大多超過1kDa，且攜帶多個負(fù)電荷。由于其分子量較大，一般出現(xiàn)在水解初期，因此酪蛋白水解需控制在低水解度范圍內(nèi)。再采用5kDa超濾膜將產(chǎn)物多肽從反應(yīng)體系中分離出來，截留酶和未反應(yīng)的底物，并用1kDa去除小分子量多肽，再利用鈣-乙醇沉淀法獲得磷酸肽，最后采用強(qiáng)陽離子交換層析進(jìn)行分級，經(jīng)過質(zhì)譜鑒定與Sequest數(shù)據(jù)庫檢索確定磷酸肽序列?；谠摴に?，可獲得帶有多個磷酸化基團(tuán)的多肽，具有很好的抗齲齒、免疫調(diào)節(jié)和補(bǔ)充礦物質(zhì)元素等生物學(xué)功能，并為磷酸蛋白質(zhì)組學(xué)提供質(zhì)譜或機(jī)理分析的樣品。

本發(fā)明目的是提供一種富含多磷酸化多肽的酪蛋白水解物是以酪蛋白為原料，采用蛋白水解酶進(jìn)行適度水解，水解度需控制10％以內(nèi)，沸水浴加熱滅酶，采用5kDa超濾膜從反應(yīng)體系中分離出各種產(chǎn)物多肽，再將該產(chǎn)物用1kDa的超濾膜進(jìn)行截留，所得截留液采用鈣-乙醇選擇性沉淀磷酸肽，再將其用去離子水或揮發(fā)性鹽溶液溶解，上樣到強(qiáng)陽離子交換柱上，分離獲得帶多個磷酸化的多肽，采用噴霧干燥或冷凍干燥獲得產(chǎn)品。

所述的多肽均含有多個磷酸化基團(tuán)，共檢出9個多磷酸化多肽(占水解產(chǎn)物中所有磷酸肽的30％)，每個多肽所帶磷酸化基團(tuán)至少4個。

本發(fā)明的富含多磷酸化多肽的酪蛋白水解物的制備方法包括的步驟：

1)酪蛋白的溶解：將酪蛋白溶解在指定pH(7.0-9.0)的堿性溶液中，配制成10-30g/L的蛋白溶液，滴加堿或者酸調(diào)節(jié)到指定pH值。

2)酶解：將蛋白溶液置于持續(xù)攪拌且恒溫30-40℃的反應(yīng)器中，按照酶與底物的質(zhì)量比為1∶(10-1000)加入蛋白水解酶，開始反應(yīng)并計時。控制反應(yīng)體系的水解度小于10％，停止反應(yīng)，沸水浴滅酶。

3)5kDa超濾膜分離：將步驟2)獲得的酶解液置于5kDa膜分離裝置中，通過膜過濾截留分子量較大的底物和蛋白酶，得到低于5kDa分子量的水解產(chǎn)物。

4)1kDa超濾膜分離：將步驟3)獲得的水解產(chǎn)物置于1kDa膜分離裝置中進(jìn)行過濾，獲得分子量1-5kDa的截留液。