[發(fā)明專(zhuān)利]一種提取棉花線粒體及其RNA的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010268760.2
• 申請(qǐng)日: 2010-08-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN102382793A
• 公開(kāi)（公告）日: 2012-03-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 華金平;李雙雙;蘇愛(ài)國(guó);王玉美;熊敏;雷彬彬
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N5/04
• 分類(lèi)號(hào): C12N5/04;C12N15/10
• 代理公司: 北京紀(jì)凱知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;任鳳華

1.提取棉花線粒體的方法，包括如下步驟：

(1)將棉花黃化苗的根進(jìn)行液氮研磨，然后加入4℃預(yù)冷的溶液甲，振蕩混勻，冰上靜置2-30min；溶液甲由溶液A和蛋白酶K組成，蛋白酶K的濃度為0.01-1mg/mL；

(2)4℃、500-2000×g離心5-40min，取上清液；然后4℃、1000-4000×g離心5-40min，取上清液；然后4℃、8000-30000×g離心15-120min，取沉淀物；

(3)用溶液A洗滌重懸沉淀物，8000-30000×g離心15-120min，收集沉淀物，即為線粒體；

所述步驟(1)和步驟(3)中的溶液A由NaCl、Tris-HCl、EDTA-Na₂、DEPC水、PVP-40、BSA和β-巰基乙醇組成；溶液A中，NaCl的濃度為0.5-2.0mol/L，Tris-HCl的濃度為0.01-1.00mol/L，EDTA-Na₂的濃度為0.5-4mmol/L，PVP-40的濃度為0.5-5％(體積百分含量)，BSA的濃度為0.05-0.5％(體積百分含量)，β-巰基乙醇的濃度為1-10mmol/L。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述步驟(1)中，冰上靜置的時(shí)間為2-5min或5-30min，優(yōu)選為5min；所述步驟(3)中的離心條件為8000-16000×g離心15-40min或16000-30000×g離心40-120min，優(yōu)選為16000×g離心40min；所述步驟(2)為：4℃、500-1000×g離心5-10min，取上清液；然后4℃、1000-2600×g離心5-15min，取上清液；然后4℃、8000-16000×g離心15-40min，取沉淀物；或所述步驟(2)為：4℃、1000-2000×g離心10-40min，取上清液；然后4℃、2600-4000×g離心15-40min，取上清液；然后4℃、16000-30000×g離心40-120min，取沉淀物；所述步驟(2)優(yōu)選為：4℃、1000×g離心10min，取上清液；然后4℃、2600×g離心15min，取上清液；然后4℃、16000×g離心40min，取沉淀物。

3.如權(quán)利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述棉花黃化苗的根、所述溶液甲和所述溶液A的配比為：5-10克棉花黃化苗的根∶5-45ml溶液甲∶5-50ml溶液A。

4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于：所述棉花黃化苗的根、所述溶液甲和所述溶液A的配比為：5-10克棉花黃化苗的根∶5-30ml溶液甲∶5-20ml溶液A；或所述棉花黃化苗的根、所述溶液甲和所述溶液A的配比為：5-10克棉花黃化苗的根∶30-45ml溶液甲∶20-50ml溶液A；所述棉花黃化苗的根、所述溶液甲和所述溶液A的配比優(yōu)選為：5克棉花黃化苗的根∶30ml溶液甲∶20ml溶液A。

5.如權(quán)利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述溶液A中，NaCl的濃度為0.5-1.2mol/L或1.2-2.0mol/L，Tris-HCl的濃度為0.01-0.05mol/L或0.05-1mol/L，EDTA-Na₂的濃度為0.5-2mmol/L或2-4mmol/L，PVP-40的濃度為0.5-2.5％(體積百分含量)或2.5-5％(體積百分含量)，BSA的濃度為0.05-0.1％(體積百分含量)或0.1-0.5％(體積百分含量)，β-巰基乙醇的濃度為1-5mmol/L或5-10mmol/L；所述溶液甲中，蛋白酶K的濃度為0.01-0.1mg/mL或0.1-1mg/mL；所述溶液A中，NaCl的濃度優(yōu)選為1.2mol/L，Tris-HCl的濃度優(yōu)選為0.05mol/L，EDTA-Na₂的濃度優(yōu)選為2mmol/L，PVP-40的濃度優(yōu)選為2.5％(體積百分含量)，BSA的濃度優(yōu)選為0.1％(體積百分含量)，β-巰基乙醇的濃度優(yōu)選為5mmol/L；所述溶液甲中，蛋白酶K的濃度優(yōu)選為0.1mg/mL。

6.如權(quán)利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：所述棉花為陸地棉鄂抗棉12或中棉所12。

7.一種提取棉花線粒體RNA的方法，是將權(quán)利要求1至6中任一所述方法得到的棉花線粒體提取RNA，得到棉花線粒體RNA。