[發明專利]一種哺乳動物細胞的灌流培養方法

有效

• 申請號: 201010268418.2
• 申請日: 2010-09-01
• 公開（公告）號: CN102382794A
• 公開（公告）日: 2012-03-21
• 發明（設計）人: 趙志全;趙麗麗;夏燕
• 申請（專利權）人: 山東新時代藥業有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種哺乳動物細胞的灌流培養方法。

背景技術

動物細胞培養開始于本世紀初期，1962年其規模開始擴大，發展至今已成為生物及醫學研究和應用領域廣泛采用的技術方法。利用動物細胞培養生產具有重要醫用價值的酶、生長因子、疫苗和單抗等生物制品已占世界生物高技術產品市場份額的50％，成為生物醫藥高技術產業的重要組成部分。

動物細胞大規模培養技術是生物技術制藥中非常重要的環節，根據細胞的生長特性可分為貼壁細胞和懸浮細胞；就其培養方法而言可概括為懸浮培養和固定化培養；就操作方式而言，可分為分批式、補料-分批或流加式、半連續式、連續式或灌流式四種操作方式。流加培養和灌流培養是細胞培養模式中最常用的兩種操作方式

目前用哺乳動物細胞大規模培養生產蛋白的工業化過程，可以看作是以攪拌式生物反應器懸浮培養作為通用技術平臺，使用常用的3種細胞(CHO、SP2/0、NSO)依托該平臺工藝并使其生產能力提高。平臺工藝的特點是采用無血清培養和成熟的流加和灌流工藝。

連續灌流培養是近年用于動物細胞培養生產分泌型重組治療性藥物和嵌合抗體及人源化抗體等基因工程抗體較為推崇的一種方式。應用連續灌流工藝的公司有Genzyme，Genetic?Institute，Bayer公司等。國內第四軍醫大學、華東理工大學、中國科學院上海細胞生物學研究所等單位從事了這方面的研究。

就攪拌式生物反應器懸浮培養動物細胞的工藝而言，目前國際上流加或灌注培養生物工程細胞(如中國倉鼠卵巢細胞CHO、雜交瘤細胞hybridoma)的活細胞密度已經可以達到10⁷水平。國內的第四軍醫大學馮強等人2002年報道采用5L?CelliGen反應器連續灌注培養雜交瘤細胞，研究雜交瘤細胞在無血清培養基中的生長、代謝情況和氧消耗的關系，培養第9天細胞密度達到8×10⁶cells/mL以上。

灌流式培養的優點包括：細胞截流系統可使細胞或酶保留在反應器內，維持較高的細胞密度，一般可達10⁷-10⁹cells/mL，從而較大的提高了產品的產量；2連續灌流系統，使細胞穩定的處在較好的的營養環境中，有害代謝廢物濃度積累較低；3反應速率容易控制，培養周期較長，可提高生產率，目標產品回收率高；4產品在罐內停留時間短，可及時回收到低溫下保存，有利于保持產品的活性。

這種方法最大困難是污染機率較高，長期培養中細胞分泌產品的穩定性問題，規模放大過程中工程問題。

目前動物細胞大規模灌流培養技術水平的提高主要集中在培養規模的進一步擴大、細胞培養環境的優化、細胞特性的改變、產率和產品質量的提高等方面。其中最根本的是優化細胞的培養條件，盡可能消除或減輕環境對細胞的影響，維持細胞高存活力和高效表達，同時也要充分考慮細胞表達產物的后續純化。

理論上講，哺乳動物細胞表達系統產生的目的蛋白一般為糖蛋白，此類重組融合蛋白由于結構復雜，其在細胞內組裝，轉運及分泌至胞外的過程中，有可能會因為培養環境的影響產生二硫鍵的錯配而形成錯誤折疊的蛋白，或者形成兩種異構體，繼而影響蛋白結構域的活性。因此，通過對發酵條件的控制可以減少蛋白錯誤折疊或者降低無活性異構體的表達量。

很多的文獻或者專利介紹了動物細胞培養條件的優化，包括pH、溶氧、溫度和攪拌轉速等。

陳志南在CN1557948A中將溫度36-37、pH6.5-7.4、攪拌速度控制為40-80rpm，并在此基礎上調整了營養物質的流速，在使用雜交瘤細胞培養生產單克隆抗體中取得了較好的效果。

B.M.施林在CN101044239A《用于蛋白質生產的哺乳動物細胞培養方法》中在培養期間采用了兩次溫度轉換，其中在培養期結束時溫度低于最初細胞培養時溫度。這種調整維持了高細胞生存力，可以產生蛋白質產物的更大的終末滴定度，和高質量蛋白質產物。

Helmut在US7,157,557B2中的研究表明培養液的pH的改變可以導致目的蛋白中組分的含量發生變化，溫度的改變可以降低蛋白的錯誤折疊率。

TEIJIN?LTD在日本專利申請JP5146290公開了在細胞濃度和葡萄糖濃度下灌注培養哺乳動物細胞的技術方案，灌注培養哺乳動物細胞人B細胞雜交瘤，穩定期保持培養基(ITES-Erdf，包含轉鐵蛋白、胰島素、乙醇胺、亞硒酸鈉)中葡萄糖濃度在3.5-30mmol/l，細胞密度超過8×10⁶cells/mL。