[發明專利]新型人腫瘤壞死因子受體-Fc融合基因及其產物蛋白

在審

• 申請號: 201010268409.3
• 申請日: 2010-09-01
• 公開（公告）號: CN102382850A
• 公開（公告）日: 2012-03-21
• 發明（設計）人: 趙志全;趙麗麗;夏燕
• 申請（專利權）人: 山東新時代藥業有限公司
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/63;C12N5/10;C07K19/00
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技術領域

本發明屬于基因工程制藥領域，具體涉及一種新型TNFR-Fc融合基因及其表達產物。

背景技術

類風濕性關節炎(Rheumatoid?Arthritis，RA)是人類最常見的自身免疫性疾病之一，患病率約1％，與人類白細胞抗原DR4/DR1明顯相關，具有一定的遺傳傾向。RA的臨床特征多為手、足、腕、膝、臀等的關節滑膜發炎，最終導致關節損傷。滑膜炎引起大量淋巴細胞浸潤，主要包括巨噬細胞、T淋巴細胞和漿細胞，同時血管增生。關節損傷主要發生于滑膜與軟骨和骨毗鄰處。

RA是一種以累及關節為主的系統性自身免疫性疾病。近年來研究表明，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)是RA發病機制中的關鍵因子(Feldmann?M?2001；RavinderN?Maini，2001；RavinderN?Maini，199)，其可刺激機體產生一系列因子，如白細胞介素(IL)-1、IL-6、IL-8和粒細胞集落刺激因子等的產生，并誘導內皮細胞表達黏附分子，吸引白細胞到受累關節。TNF-α還刺激滑膜巨噬細胞、纖維母細胞、破骨細胞和軟骨細胞產生基質金屬蛋白酶，并抑制軟骨蛋白聚糖的合成，并可導致滑膜炎癥和關節軟骨的損傷。阻斷TNF-α即可在RA發病機制的上游阻斷炎癥反應，達到治療RA的目的。

腫瘤壞死因子α(Tumor?Necrosis?Factor?Alpha，TNFα)和淋巴毒素(Lymphotoxin，LT)是通過與其共同受體TNFR75和TNFR55結合而發揮生物學作用的。人腫瘤壞死因子受體75(TNFR75)由461個氨基酸組成，其N-末端235個氨基酸殘基，是TNFR75蛋白酶水解下來的細胞膜外區片段，也稱為可溶性TNFR75(sTNFR75)。

大量實驗證據表明可溶性TNFR75和TNFR55(即受體的膜外部分)可以通過與TNFα和LT的有效結合而阻斷TNFα和LT在生物體內的生物學作用(Hunns-Martin?Lorenz，2002；smith，C.A.等(1990)，science，248：1019-1023)，且TNFR75分布更廣發，親和能力更強。但TNFR半衰期較短。

人IgG類免疫球蛋白半衰期可高達21天，它們是人類血液中最豐富的蛋白質，分為IgA、IgG、IgM、IgE和IgD，其中IgG有IgG1、IgG2、IgG3和IgG4四個亞型。IgG1Fc段由232個氨基酸殘基組成，包括鉸鏈區、CH2區和CH3區。已有報道說將IgG的Fc絞鏈區中的半胱氨酸殘基與其他蛋白質(如各種細胞因子和可溶性受體)結合而形成融合蛋白，使蛋白質類似于IgG分子但無CH1區域和輕鏈。由于結構上的同源，Fc融合蛋白表現出與類似同種型的人IgG相當的體內藥物動力學特性。

國外已有人借助基因工程手段構建了人TNFRII型受體部分與IgG的Fc片段的融合蛋白，此蛋白在離體條件下對TNF有中和作用(美國專利5,605,590)。國內也有構建此類融合蛋白，馬菁等在CN1417334A腫瘤壞死因子受體可溶部分的重組基因，及融合蛋白基因與產物中構建了一種含有linker的融合蛋白；劉昌閭等在CN1502632A新型TNFR-Fc融合蛋白中構建了一種截短的融合蛋白；徐斌等在CN101003575中利用雙順反子構建了一種人腫瘤壞死因子可溶性受體Ⅱ-抗體FC段融合蛋白。

這類藥物人源化程度高，引起的免疫原性反應低，治療效果很好，比單靠止痛藥和抗炎藥更有效控制病情。但目前這類治療藥物普遍存在制備方法復雜，表達量低，價格昂貴等丞待解決的問題。

發明內容

本發明解決的一個問題是提供了一種新型的重組人TNFR75-Fc融合基因，及其表達的蛋白質產物。

本發明解決的第二個問題是構建了一種含有重組人TNFR75-Fc融合基因片段的重組載體pCI-gs-TNFR75-Fc，轉染哺乳動物細胞后，其真核細胞的擴增標記，可大幅提高目的基因在宿主細胞中的拷貝數，從而提高目的蛋白的表達量。

本發明解決的第三個問題是，提供了一種含有重組載體pCI-gs-TNFR75-Fc的哺乳動物細胞，可以穩定表達TNFR75-Fc。所述哺乳動物細胞可以是CHO細胞、NSO細胞等常用哺乳動物細胞工程細胞株。

本發明解決的第四個問題是通過硫氨甲硫氨酸(MSX)加壓擴增篩選，使表達目的蛋白細胞株表達量提高至少一個數量級，在進行高效表達細胞株篩選時，最終將MSX濃度提高到400～500μm，篩選單克隆表達量達到20～30pg/cell·24hr。