[發明專利]鴨源性冠狀病毒ORF1a蛋白基因及其克隆方法與應用

無效

• 申請號: 201010264772.8
• 申請日: 2010-08-27
• 公開（公告）號: CN101962648A
• 公開（公告）日: 2011-02-02
• 發明（設計）人: 劉興友;姚四新;趙淑秋;王憲文;劉金華;王麗榮;王自良;趙坤;王三虎;王青
• 申請（專利權）人: 河南科技學院
• 主分類號: C12N15/50
• 分類號: C12N15/50;C12N15/10;C07K14/165;A61K48/00;A61K39/215;A61P31/14;A61P11/00
• 代理公司: 鄭州大通專利商標代理有限公司 41111
• 代理人: 樊羿

1.一種鴨源性冠狀病毒的ORF1a蛋白基因，其特征在于，該基因的核苷酸序列如SEQ?ID?No.1所示。

2.一種鴨源性冠狀病毒的ORF1a蛋白基因，其特征在于，該基因的氨基酸序列如SEQ?ID?No.2所示。

3.一種鴨源性冠狀病毒的ORF1a蛋白基因的克隆方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)選取鴨源性冠狀病毒ZZ2004株，以鴨源性冠狀病毒ZZ2004株的同源序列為模板設計出如下十二對引物：

片段??位置(nt)??????長度(nt)????上游引物(nt)????????????下游引物(nt)

V1????79～1402??????1324????????CCTACAGCTGGTCCTCATAG????TAGTACCTCTCGGTGCATTT

V2????1305～2363????1059????????CTGGTTTTATGGGTGCTAAG????GGACAATACCCAGATCTTCA

V3????2238～3402????1165????????GCACTTGGTAGAGTTTCTGG????TAAACTCGTCGACATCCTCT

V4????3061～4462????1402????????ATTGTACACAAGGACGCTCT????AGGCAACAAAGTCTGTAGGA

V5????4313～5327????1015????????TGTACTTAAGTGGCGTGATG????AGCACTACCTTCAACCCATA

V6????5262～6338????1077????????GCACCAATTTACTACCCAGT????GCTAACTTCATGCCTATTGC????

V7????6293～7329????1037????????TGAAGTGTGCAAGAGAGTTG????TACCACTAATGACACCACCA

V8????7088～8963????1876????????CTCGTGATAGAGGGTTTTTG????CCTAGCCACAGTCCATTAAG

V9????8764～9812????1049????????GGTTAGCTTATGCTTTGGAC????CCAAAACCAAGATGTAGCTC

V10???9621～10441???821?????????AGTGCTATAACGGGAGTTGA????CCTAAGCCATTAACCATGAC

V11???10252～11186??935?????????TTACTGCATACTCGGAAGGT????CGCGTGTAGTGATGAAACTA

V12???11100～12099??1000????????AGTCAGTAGACAGCGGAGAG????GGTCACGAGTACCCTGATTA

2)通過RT-PCR的方法擴增出鴨源性冠狀病毒ZZ2004株ORF1a蛋白基因全長片段，PCR的擴增條件94℃，5min；94℃1min，53℃1min，72℃1min，共35個循環，最后于72℃延伸10min，4℃結束反應；

3)然后將ORF1a蛋白基因片段分別與pMD18-T載體連接。

4.權利要求1或2所述鴨源性冠狀病毒的ORF1a蛋白基因在制備IBV基因工程亞單位蛋白疫苗中的應用。

5.權利要求1或2所述鴨源性冠狀病毒的ORF1a蛋白基因在制備防治雞傳染性支氣管炎藥物中的應用。