[發明專利]一種檢測羊駝副結核分支桿菌抗體的試劑盒及其檢測方法

無效

• 申請號: 201010264687.1
• 申請日: 2010-08-26
• 公開（公告）號: CN101949928A
• 公開（公告）日: 2011-01-19
• 發明（設計）人: 唐泰山;廉慧鋒;張常印;王凱民;姜焱;祝長青;張睿
• 申請（專利權）人: 江蘇出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心
• 主分類號: G01N33/569
• 分類號: G01N33/569
• 代理公司: 南京眾聯專利代理有限公司 32206
• 代理人: 王荷英

1.一種檢測羊駝副結核分支桿菌抗體的試劑盒，包含下列試劑：

(1)副結核分支桿菌重組hed蛋白；

(2)羊駝副結核陽性對照血清、陰性對照血清。

2.根據權利要求1所述的檢測羊駝副結核分支桿菌抗體的試劑盒，其特征在于還包含酶標板、包被液、封閉液、PBST、辣根過氧化物酶標記的金黃色葡萄球菌蛋白A、顯色液配制原料和終止液；

所述包被液是濃度為1mol/L的Tris-HCl緩沖液，pH?7.5；

所述封閉液是質量濃度為2％的明膠溶液；

所述PBST的組成是：Na₂HPO₄?2.9g/L，KH₂PO₄?0.2g/L，NaCl?8.0g/L，KCl?0.2g/L，Tween-20體積濃度為0.05％，其pH為7.4；

所述顯色液配制原料包括：①由Na₂HPO₄·12H₂O?18.408g/L，檸檬酸5.106g/L組成的磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液，pH?5.0；②鄰苯二胺；③體積濃度為30％的H₂O₂水溶液；

所述終止液是濃度為2mol/L的H₂SO₄溶液。

3.一種采用權利要求2的試劑盒檢測羊駝副結核分支桿菌抗體的方法，按如下步驟：

(1)、包被：副結核分支桿菌重組hed蛋白用包被液稀釋至3.75μg/mL，于酶標板各孔中分別加入100μL，4℃包被過夜，用PBST洗滌5次；

(2)、封閉：每孔加入300μL封閉液，4℃封閉過夜，用PBST洗滌5次；

(3)、加入待檢樣品：以PBST分別將陽性對照血清、陰性對照血清、待檢血清按體積1∶50稀釋，每孔中加入100μL，37℃孵育60min，用PBST洗滌5次；

(4)、加入辣根過氧化物酶標記的金黃色葡萄球菌蛋白A：用PBST將辣根過氧化物酶標記的金黃色葡萄球菌蛋白A作1∶5000稀釋，每孔中加入100μL，37℃孵育60min，用PBST洗滌5次；

(5)、配制并加入顯色液：臨顯色之前向所述磷酸鹽-檸檬酸鹽緩沖液中加入鄰苯二胺，使鄰苯二胺濃度達到0.4g/L，然后加入所述的H₂O₂水溶液0.15mL，即獲得顯色液；每孔加入該顯色液100μL，37℃避光孵育15min；

(6)、終止：每孔加入100μL終止液終止反應，酶標儀測定每孔的OD_490nm值；

(7)、判定：待檢血清孔的OD_490nm值≥陰性對照血清孔的OD_490nm值+0.24，判為陽性；反之判為陰性。