[發明專利]腸出血性大腸桿菌O157:H7多色量子點快速檢測試劑盒及其檢測方法

有效

• 申請號: 201010264295.5
• 申請日: 2010-08-27
• 公開（公告）號: CN101935703A
• 公開（公告）日: 2011-01-05
• 發明（設計）人: 羅陽;高維寅;陳鳴;張波;萬瑩鏵;羅燦;府偉靈
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三軍醫大學第一附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10;C12Q1/06;G01N21/64
• 代理公司: 北京同恒源知識產權代理有限公司 11275
• 代理人: 趙榮之

技術領域

本發明涉及一種檢測試劑盒，特別涉及腸出血性大腸桿菌O157:H7多色量子點快速檢測試劑盒，還涉及該試劑盒的檢測方法。

背景技術

大腸桿菌O157:H7是腸出血性大腸桿菌(EHEC)的一個主要血清型，感染該菌可使人患腹瀉和出血性結腸炎，也可引發溶血性尿毒綜合征及血栓形成性血小板減少性紫癜等嚴重并發癥，嚴重者可導致死亡。EHEC?O157的感染因具有暴發流行趨勢、強烈的致病性與致死性和抗生素治療可加劇病情的危險性等特點，已經成為全球性的公共衛生問題。

EHEC?O157:H7感染的死亡率之所以高居不下，主要原因之一就是EHECO157:H7難以在早期被快速、準確地檢測出來。目前，臨床上對EHEC?O157:H7主要采用傳統的增菌培養、分離提純、生化實驗和血清學實驗進行檢測，存在操作繁瑣、費時等缺點。近年來已有文獻報道采用PCR、酶譜分析、高效液相色譜分析、代謝指紋法等新技術檢測EHEC?O157:H7，但這些方法存在特異性不強、假陽性結果較高等缺點。因此，建立一種準確、快速的EHEC?O157:H7檢測方法，是臨床的迫切需求。

核酸分析，尤其是核酸原位雜交，作為一種準確、快速的分析方法，近年來在病原菌鑒定方面受到越來越多的關注。其基本原理是將帶有發光標記物的能夠識別特定核酸序列的寡核苷酸探針與待測核酸樣本進行雜交反應，將雜交反應結果轉化為可以讀取的光信號，從而實現對待測核酸樣本中特定核酸序列的定性或定量檢測。傳統的發光標記物多采用有機熒光染料，但其存在熒光強度弱、檢測靈敏度較低；不同熒光染料的光譜間干擾嚴重，檢測特異性較弱；光漂白現象明顯，檢測重復性較差等缺點，使熒光核酸雜交技術的發展和應用受到一定限制。

量子點(QDs)的出現為克服以上問題帶來了希望。量子點是一種由周期表中II-VI族或III-V族元素組成，直徑在1～10nm之間，能夠接受激發光產生熒光的半導體納米顆粒。與傳統的有機熒光染料相比，量子點具有許多獨特的理化特性：①發射波長可調諧，可以通過控制量子點的粒徑大小來調節其發射熒光的顏色；②激發波長范圍寬，從紫外區到近紅外區，可以用同一波長的光激發不同發射波長的量子點；③發射峰狹窄且對稱，半峰寬通常為25～45nm；④熒光強度高且穩定，對光漂白有強烈的抵制作用。由于這些獨特的量子優勢，近年來將量子點應用于熒光材料的替代研究更為深入，范圍不斷擴展。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的之一在于提供一種EHEC?O157:H7多色量子點快速檢測試劑盒，目的之二在于提供所述EHEC?O157:H7多色量子點快速檢測試劑盒的檢測方法，以滿足臨床對準確、快速檢測EHEC?O157:H7的迫切要求。

為達到上述目的，本發明采用如下技術方案：

1、EHEC?O157:H7多色量子點快速檢測試劑盒，包含以下試劑：

①固定在固相載體上的捕獲探針；

②三種分別用熒光發射波長互不重疊的量子點標記的檢測探針：O157抗原編碼基因rfbE探針、溶血性基因HlyAB探針和志賀毒素基因stx2探針；

③核酸樣本的PCR擴增引物A組或B組：所述PCR擴增引物A組用于擴增分別包含O157抗原編碼基因rfbE片段、溶血性基因HlyAB片段和志賀毒素基因stx2片段中的一種、以及與捕獲探針結合片段的PCR產物；所述PCR擴增引物B組用于擴增同時包含O157抗原編碼基因rfbE片段、溶血性基因HlyAB片段、志賀毒素基因stx2片段、以及與捕獲探針結合片段的PCR產物。

在本發明中，捕獲探針用于捕獲PCR產物，其與PCR產物中與捕獲探針結合片段的核苷酸序列互補，二者可通過雜交結合，從而將PCR產物捕獲至固相載體上。在實際應用時，捕獲探針和與捕獲探針結合片段的核苷酸序列可根據需要進行選擇和優化，優選地，與捕獲探針結合片段的序列為EHEC?16S?rDNA保守序列，捕獲探針的序列為EHEC?16S?rDNA保守序列的互補序列。EHEC?16SrDNA保守序列具有種屬特異性，可進一步增強本發明的檢測特異性。