[發明專利]基于過氧化氫的井岡霉素優化發酵方法

無效

• 申請號: 201010264100.7
• 申請日: 2010-08-27
• 公開（公告）號: CN101914600A
• 公開（公告）日: 2010-12-15
• 發明（設計）人: 鐘建江;魏振華;白林泉;鄧子新
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12P19/46
• 分類號: C12P19/46;C12R1/55
• 代理公司: 上海交達專利事務所 31201
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

技術領域

本發明涉及的是一種生物工程與技術領域的方法，具體是一種基于過氧化氫的井岡霉素優化發酵方法。

背景技術

在1970年日本武田株式會社農藥研發部門的Iwasa等人通過篩選對瘟枯病病原菌絲核菌的抑制作用獲得了能夠產生抗水稻紋枯病代謝物的鏈霉菌菌株，經鑒定為吸水鏈霉菌檸檬變種(Streptomyces?hygroscopicus?var.limoneus?T-7545)。通過分離獲得了有效霉素的A，B組分，并且較為系統的研究了該菌株的生長特性，并初步探索了生產抗生素的條件。我國上海農藥所在1973年在井岡山地區篩選到吸水鏈霉菌的一個亞種，研究表明該菌能夠產生一種與有效霉素理化性質類似的新型抗生素，取名吸水鏈霉菌井岡變種，并于1975年成功的開發了農藥制劑，我國獨立研發的這種抗生素被稱為井岡霉素(Jinggangmycin)。隨后的研究證明井岡霉素與有效霉素具有相同的組分和化學性質。

有效霉素并非一個單一組分，1988年報道了有效霉素A，B，C，D，E，F等組分的結構，隨后又報道了G和H，他們都是在相同的骨架結構上進行的一系列衍生，其中A組分的抗菌活性最強，A，B兩個組分占全部同系物的79％以上。

井岡霉素自發現以來，國內外對井岡霉素的菌種選育，培養基優化，發酵條件調控，分離純化以及制劑研究等方面都做了大量的卓有成效的研究。隨后經過20多年的不斷選育和優化，工業產量不斷提高。通過菌種選育可以大幅度的提高抗生素的產量，井岡霉素產生菌同樣也表現出了巨大的增產潛力。從1973年產有效霉素出發菌的數百單位的產量，經過一年的篩選便達到了1萬個單位。30年來通過各種方法不斷進行的選育，目前的有效霉素高產菌株發酵穩定在2萬單位效價左右。發酵培養基也是影響抗生物生產的重要因素，在國內利用吸水鏈霉菌井岡變種生產有效霉素的研究與實踐中，科研人員逐步探索出了一系列經過優化的高產培養基。發酵溫度會直接或間接影響培養細胞的生理生化，從而最終影響發酵目標產物的生產量。我們研究發現在高溫發酵條件下會在發酵前期帶來快速的蛋白合成，快速的糖消耗，快速的pH上升，而這三者恰好與最快速的有效霉素產生階段相互重合。這說明高溫發酵對細胞的整個代謝造成了全局性的影響，其中包括對有效霉素合成的巨大提高。

細胞在收到氧化壓力刺激下，會產生大量的活性氧，活性氧可作為信號分子進一步激活下游基因的轉錄，從而調節了細胞的多個過程。在植物細胞中已報道通過各種方法刺激活性氧的產生，活性氧作為信號分子促進了代謝產物的大量合成。微生物細胞也可通過以下壓力相應的sigma因子調節相應的基因表達，從而促進次級代謝產物的合成。而在氧化壓力下，細胞還可以改變其代謝流的流向，使代謝流由糖酵解途徑流向戊糖磷酸途徑。而井岡霉素合成的前體7-磷酸景天庚酮糖正是戊糖磷酸途徑中的中間代謝物。因此，我們通過外源添加過氧化氫策略的優化提高了井岡霉素的產量。

經過對現有技術的檢索發現，在野油菜黃單孢菌中次氯酸的添加誘導了活性氧的產生對黃原膠的產量起到了促進作用，黃原膠產率有210％的提高，總產量也有20％以上的提高。目前該技術尚未見其應用到井岡霉素發酵生產過程。吸水鏈霉菌5008是一株有潛力的井岡霉素生產菌株，但目前其產量還較低，發酵周期較長。經過42攝氏度的高溫發酵，雖然其產量有一定提高，但高溫必然帶來大的能量消耗。如何在較低溫度下進一步提高井岡霉素發酵產量以及縮短其發酵周期是一個亟待解決的問題。

發明內容

本發明針對現有技術存在的上述不足，提供一種基于過氧化氫的井岡霉素優化發酵方法，通過過氧化氫添加時間和濃度的優化，使井岡霉素發酵產量提高40％左右，同時發酵周期也縮短一天，提高了設備利用率，降低了能耗。此方法應用到調節基因突變的菌株中，也可提高突變株的井岡霉素產量。本發明為提高井岡霉素產量提供了一種簡便有效的方法，為在工業生產中的應用提供基礎。

本發明是通過以下技術方案實現的，本發明通過在吸水鏈霉菌井岡變種孢子的發酵培養階段滴加過氧化氫溶液實現產量優化。

所述的吸水鏈霉菌井岡變種孢子是指：取吸水鏈霉菌井岡變種孢子的懸液劃線平板在37攝氏度環境下培養5天；

所述的孢子懸液為零下20攝氏度保存的吸水鏈霉菌井岡變種孢子懸液

所述的發酵培養階段是指：將吸水鏈霉菌井岡變種孢子接種于發酵培養液中并在30攝氏度、220轉速度下旋轉培養24小時后發酵培養5天；

所述的接種是指：以種子液：發酵培養液為1∶10(v/v)的比例接種培養，