[發明專利]一種提高玉米轉基因效率的花粉管通道轉化體系及方法

無效

• 申請號: 201010263566.5
• 申請日: 2010-08-26
• 公開（公告）號: CN102031273A
• 公開（公告）日: 2011-04-27
• 發明（設計）人: 吳忠義;羅昌;黃叢林;張秀海;梁宏霞;李春華;程曦
• 申請（專利權）人: 北京農業生物技術研究中心
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 北京國林貿知識產權代理有限公司 11001
• 代理人: 李桂玲;孔祥玲

技術領域

本發明屬于植物轉基因領域，具體涉及一種提高玉米轉基因效率的花粉管通道轉化體系及方法；該轉化體系中，含有質粒DNA溶液和Silwet?L-77；所述的Silwet?L-77和所述的質粒DNA溶液的體積比為0.01%～0.05%（V/V）；該轉化方法的步驟為選取自交授粉后的玉米的果穗的苞葉和花絲，將所述的轉化體系滴在切口凹陷處。

背景技術

在玉米的轉基因方法研究中，已經報道了多種可行方法可以將外源基因導入玉米中并得以穩定遺傳，這些方法包括基因槍法，PEG介導法，電激法，農桿菌介導法和花粉管通道法。在這些轉化方法中大多依賴于玉米的組織培養技術，玉米的組織培養受基因型和受體范圍的限制比較大，而花粉管通道轉化法不依賴于植物的組織培養技術，無需昂貴的儀器設備，不受自交系品種和轉化基因類型的限制，以及可進行規模化轉化等優點，因此備受人們的青睞。

花粉管通道轉化法的主要原理是授粉后使外源DNA能沿著花粉管滲入，經過珠心通道進入胚囊，轉化尚不具備正常細胞壁的卵、合子或早期胚胎細胞。周光宇（1979）認為可以利用植物授粉后所形成的天然花粉管通道(花粉管引導組織)，經珠心通道將外源DNA攜帶進入胚囊，轉化受體為受精卵或其前后的生殖細胞(精子或卵子)，由于它們仍處于未形成細胞壁的類似“原生質體”狀態，并且正進行活躍的DNA復制、分離和重組，所以很容易將外源DNA片段整合到受體基因組中，以達到遺傳轉化的目的（《遠緣雜交的分子基礎-DNA?片段雜交假說的一個論證》遺傳學報，1979，6（4）：?405-413）。但目前玉米花粉管通道法還存在轉化效率較低的問題，轉化率為0.36%-5.2%不等（關淑艷，張健華，柴曉杰，馬義勇，曲同寶，孫?波，王丕武；《花粉管通道法將淀粉分支酶基因反義表達載體轉入玉米自交系的研究》；玉米科學，2005，13（4）：13-15）、(王罡，張艷貞，魏松紅，胡應剛，吳穎，季靜；《花粉管通道法將Bt?毒蛋白基因導入優良玉米自交系》；吉林農業大學學報，2002，24（4）：40-44）。

因此，在農業科研及生產中需要一種轉化效率高、操作簡便、能將含有目的DNA的質粒DNA溶液直接轉入玉米的提花粉管通道轉化體系及其轉化方法。

發明內容

本發明提供一種提高玉米轉基因效率的花粉管通道轉化體系及方法，該轉化體系中，含有質粒DNA溶液和Silwet?L-77；所述的Silwet?L-77和所述的質粒DNA溶液的體積比為0.01%～0.05%（V/V）；該轉化方法的步驟為選取自交授粉后的玉米的果穗的苞葉和花絲，將所述的轉化體系滴在切口凹陷處。本發明轉化效率高、操作簡便、適用的玉米范圍廣泛。

本發明的目的是由以下技術方案實現的：

一種提高玉米轉基因效率的花粉管通道轉化體系，所述的轉化體系中，含有質粒DNA溶液和Silwet?L-77；所述的Silwet?L-77和所述的質粒DNA溶液的體積比為0.01%～0.05%（V/V）。

所述的質粒DNA溶液中的質粒帶有植物除草劑篩選標記基因Bar。

所述的質粒為pBPC-Zmpti1-bar、pBPC-P5CS-F129A、PBI121-bar-TPS1、PGreen0229-RD29A-CBF4-DHA。

本發明的目的是由以下另一技術方案實現的：

一種提高玉米轉基因效率的花粉管通道轉化方法，提高玉米轉基因效率的花粉管通道轉化體系轉化體系中，含有質粒DNA溶液和Silwet?L-77；所述的Silwet?L-77和所述的質粒DNA溶液的體積比為0.01%～0.05%（V/V）；所述的轉化方法的步驟為：選取自交授粉后的玉米的果穗，剪去苞葉和花絲，將所述的轉化體系滴在切口凹陷處；使外源DNA經花粉進入時形成的通道進入幼胚，從而完成外源DNA導入過程。

所述的玉米為玉米自交系178、501、517，MO17、C7-2、吉444、京24。

本發明與現有技術相比具有以下有益效果：

1、本發明在質粒DNA溶液中添加合適濃度的表面活性劑Silwet?L-77，故可以改善含質粒DNA溶液的表面活性，有利于DNA溶液在玉米花絲或柱頭上的潤濕、粘附與滲透，增加玉米花粉管對DNA的吸收率，從而提高外源DNA片段整合到受體玉米基因組中的效率。

2、本發明中，因為是直接將含有目的DNA的質粒DNA溶液直接轉入玉米中，不依賴于玉米的組培再生體系，所以操作簡便，無需昂貴儀器，生產成本低廉。