[發明專利]甜高粱幼穗愈傷組織再生體系建立的方法

有效

• 申請號: 201010261937.6
• 申請日: 2010-08-24
• 公開（公告）號: CN101946706A
• 公開（公告）日: 2011-01-19
• 發明（設計）人: 黃大昉;朱莉;郎志宏;李桂英
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 北京海虹嘉誠知識產權代理有限公司 11129
• 代理人: 胡敬紅

技術領域

本發明屬于植物基因工程技術領域，特別是涉及甜高粱幼穗愈傷組織再生體系建立的方法。

背景技術

甜高粱是普通高粱的一個變種，生長耗水量僅為玉米的1/3，畝產可高達5～10噸，其莖稈汁液是發酵制造酒精和培養酵母的理想生物質原料。用甜高粱取代玉米等糧食作物作為原料生產酒精的新工藝，不僅能節約糧食、降低成本，有力地帶動發酵產業、振興酒精生產行業、而且能推進可再生能源事業和畜牧業的發展。發展甜高粱產業關鍵在于甜高粱新品種的選育與高效栽培。傳統育種技術在甜高粱的產量、品質、抗病、抗蟲等特性改良方面已發揮了重要作用，但在生產上對品種、品質要求日益提高的情況下，因受現有資源的限制，單靠傳統的育種方法難以取得重大突破。利用轉基因技術改良高粱品種已引起廣泛的關注。植物轉基因技術通常依賴于植物快捷、高頻率再生體系的建立。然而，甜高粱同普通高粱一樣，通過組織培養獲得再生植株相對比較困難。目前針對甜高粱組織培養的研究還很少。

從甜高粱的成熟胚和未成熟胚誘導愈傷到獲得整個再生植株以前雖已有過一些報道(MacKinnon?et?al.，1986，Plant?Cell?Rep.5：349-351；Ma?et?al.，1987，Theor?App?Genet.73：389-394；Rao?and?Kavi?Kishor，1989，Curr?Sci.58：692-693)，但遺憾的是能夠從外植體誘導胚性愈傷到再生出植株的僅限于個別幾個品種(Smith?and?Bhaskaran，1986，Springer-Verlag，New?York，pp.220-223；Rao?et?al.，1995，Plant?Cell?Rep.15：72-75)。近年來隨著人們對甜高粱應用價值的重視，甜高粱組織培養方面的研究也取得了快速的發展。通過對不同基因型品種及外植體、不同培養基成分(包括蔗糖濃度和激素配比等)、不同培養條件對愈傷的誘導、增殖及分化再生能力的影響進行系統研究，為甜高粱品種建立有效的組織培養再生體系提供了參考(Zhao?et?al.，2008，Chinese?Bull?Bot.25：465-468；Zhao?et?al.，2010，African?Journal?of?Biotechnology.9(16)：2367-2374)。但以上研究大多是以甜高粱的成熟胚和未成熟胚為外植體，目前為止以幼穗為外植體的研究尚很少見有報道。

近年來各國科學家正在致力于相關方面的研究，相比其它作物，甜高粱組織培養植株再生困難，而且受基因型的限制，因此甜高粱遺傳轉化研究進展緩慢，目前尚很少見成功報道。據報道，2009年美國昆士蘭大學的研究人員培育出了世界上首例木質素含量降低的轉基因甜高粱植株，他們將編碼咖啡酰輔酶A-O-甲基轉移酶(CCoAOMT)和咖啡酸-O-甲基轉移酶(COMT)的DNA片段導入甜高粱品種中，通過改變木質素的含量和組分獲得了成功，該項研究成果已申請了專利(Pub.No.US?2010/0058496A1)。其它研究尚未見相關報道。

因此建立甜高粱的遺傳轉化體系，通過轉基因技術培育甜高粱新品種，使其更好地滿足實際生產的需求。轉化體系的研發將為綠色能源生物燃料和生物材料的開發利用開辟新的途徑。

發明內容：

本發明的目的是提供一種以甜高粱幼穗材料的組織培養形成再生體系，為以甜高粱幼穗誘導的愈傷組織的組織培養再生體系及遺傳轉化方法提供基礎研究。

甜高粱幼穗愈傷組織再生體系建立的方法，包括如下步驟：1)選取幼穗，旗葉期長約2-5cm幼穗，切成薄片，2)將其接種于誘導培養基中培養，形成愈傷組織，所述誘導培養基為：MS基礎培養基+2，4-D?2mg/L+ZT(玉米素)2.0mg/L+PVP(聚乙烯吡咯烷酮)10mg/L+抗壞血酸10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+30g/L蔗糖+7.2g/L瓊脂pH?5.8，3)將愈傷幼穗組織塊在繼代培養基中繼代培養，所述繼代培養基為：誘導培養基+KT(激動素)0.2mg/L，4)再將其接于分化培養基中培養至出苗，所述分化培養基為：MS基礎培養基+ZT2.0mg/L+KT?0.2mg/L+PVP?8-10mg/L+水解酪蛋白500mg/L+30g/L蔗糖+8.0g/L瓊脂，pH?5.8，5)將苗移入生根培養基中培養出根，所述生根培養基為：1/2MS基礎培養基+肌醇500mg/L+NAA?400mg/L+IBA?2mg/L+PVP?8-10mg/L+30g/L蔗糖+8.0g/L瓊脂，pH5.8，6)轉移至小培養缽中煉苗培養，7)移栽至溫室或大田。

優選2-3cm幼穗，薄片約3mm長。