[發明專利]用ISSR分子標記法對新疆藥用阿魏品種進行快速鑒別的方法

無效

• 申請號: 201010259524.4
• 申請日: 2010-08-23
• 公開（公告）號: CN102373269A
• 公開（公告）日: 2012-03-14
• 發明（設計）人: 凱撒·蘇來曼;趙鑫;阿依別克·熱合木都拉;朱國強
• 申請（專利權）人: 新疆維吾爾自治區中藥民族藥研究所
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 石河子恒智專利代理事務所 65102
• 代理人: 李伯勤

技術領域

本發明涉及一種用ISSR分子標記法對新疆藥用阿魏品種進行快速鑒別的方法。

背景技術

阿魏是我國傳統中藥材，其應用歷史悠久。本品為傘形科植物新疆阿魏（Ferula?sinkiangensis?K.M.Shen）或阜康阿魏（Ferula?fukanensis?K.M.Shen）的樹脂，為《中華人民共和國藥典》2005年版所收載。

阿魏始載于唐代《新修本草》，記有：“苗葉根酷似白芷。倒根汁，日煎做餅者為上，揭根穿暴干者為次。體性及臭而能止臭，亦為奇物。”因療效顯著，唐以后，歷代本草都有記載。

阿魏藥用價值：阿魏味苦、辛、性溫。歸脾、胃經。有消積，散脾，殺蟲等功效。用于肉食積滯，瘀血、腹中痞塊，蟲積腹痛等癥。阿魏成分：阿魏主要含有樹脂，樹膠和揮發油等有效成分。樹脂主要含有阿魏酸及其脂類，還有香草醛等；揮發油中主要含有蒎烯，并伴有多種二硫化合物。主要藥理作用：阿魏有雙向調節平滑肌、抗過敏、抗生育、抗潰瘍、抑菌等生理作用。

我國藥用阿魏過去主要靠進口，解放前為少數民族用藥。目前的阿魏藥材主要來源于野生資源，而且主要產于新疆地區。

由于阿魏要8年才能開花結實，而藥材又在開花結實前采割，50年代阿魏年產量幾千公斤，由于大量墾荒造田和不合理采收使植株死亡或失去生長繁殖能力，加之春季阿魏生育期正值牧草缺少季節，放牧影響了阿魏生長。自從70年代以來，隨著阿魏資源的過度開發和生態環境的破壞，阿魏藥用植物資源在自然條件下瀕臨滅絕，現在新疆阿魏和阜康阿魏皆被列為國家三級保護植物，其植物資源處于瀕危的邊緣。

同時，新疆地區的阿魏植物中僅具蒜樣異臭的少數幾種阿魏所提取的樹脂才能作為藥用，其他多達16種阿魏雖然數量和面積都非常大，也有塊狀樹脂溢出，但無特異臭味，稱為香阿魏，不能藥用。

目前藥用阿魏一般通過以下方法鑒定：一是性狀鑒別，通過外觀、顏色、氣味等進行鑒別，誤鑒率較高，二是化學鑒定，雖然鑒別相對性狀鑒別比較準確，但實施要求較高，不易進行，而且仍有很高的誤鑒率。

ISSR分子標記是簡單序列重復區間(Inter?Simpie?Sequence?Repeat，ISSR)DNA標記技術，結合了SSR和RAPD的優點，具有模板需要量少，多態性豐富，成本低，操作簡單?，穩定性高等優點，而較之?AFLP又具技術要求較低的特點。

近年來?ISSR已廣泛應用于品種鑒定、種質資源和遺傳多樣性研究等領域。

由于ISSR分子標記技術是基于PCR的一種分子標記技術，其擴增結果受模板DNA濃度、引物濃度、Taq?DNA聚合酶濃度、Mg²⁺濃度、dNTP濃度等多種因素的綜合影響，因此有必要篩選出ISSR分析對反應體系的最佳方法。

因此一種用ISSR分子標記法對新疆藥用阿魏進行快速鑒別的方法就應運而生。

發明內容

本發明的目的是提供一種能夠快速鑒別新疆藥用阿魏的方法，特別是一種用ISSR分子標記法對新疆藥用阿魏品種進行快速鑒別的方法，以實現在人工繁育中保證品種的準確性和繁育的高效性。

本發明通過以下技術方案實現：

以新疆阿魏幼苗為材料，具體方法是將解除休眠的新疆阿魏種子播于穴盤萌發幼苗，待幼苗長出兩片真葉時取樣，液氮冷凍后于-70~?-100℃保存，待用；

所使用的引物序列（5---3）為：(CT)₈RC，所用的引物濃度為：?0.6～0.85vmol/L；

基因組DNA的提取及DNA質量檢測：

采用改良的CTAB微量法提取基因組總DNA，用0.6~1.0%的瓊脂糖電泳檢測DNA質量，DNA的純度和濃度用紫外分光光度計法測定，并將DNA濃度稀釋到10~30ng/vL，于-18~?-25℃保存備用；

檢測所用的試劑：dNTPs濃度為：?0.4～0.8mmol／L，Mg²⁺濃度為：濃度為1.0～1.5mmol/L，Taq?DNA聚合酶濃度：?1.0～1.5U。

采用本ISSR分子標記法對新疆藥用阿魏進行品種鑒定、種質資源和遺傳多樣性進行研究，具有模板需要量少、多態性豐富、成本低、操作簡單、穩定性高等優點，而較之?AFLP又具技術要求較低的特點。

具體實施方式

實施例1：

材料處理：將解除休眠的新疆阿魏種子播于穴盤萌發幼苗，待幼苗長出兩片真葉時取樣，液氮冷凍后于-80℃保存，待用。