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[發(fā)明專利]一種極小類胚胎樣干細胞的制備方法有效

專利信息
申請?zhí)枺?/td> 201010259151.0 申請日: 2010-08-23
公開(公告)號: CN102373176A 公開(公告)日: 2012-03-14
發(fā)明(設(shè)計)人: 楊躍進;徐輝;錢海燕 申請(專利權(quán))人: 楊躍進;徐輝;錢海燕
主分類號: C12N5/0775 分類號: C12N5/0775
代理公司: 暫無信息 代理人: 暫無信息
地址: 100037 *** 國省代碼: 北京;11
權(quán)利要求書: 查看更多 說明書: 查看更多
摘要:
搜索關(guān)鍵詞: 一種 極小 胚胎 干細胞 制備 方法
【權(quán)利要求書】:

1.一種極小類胚胎樣干細胞的制備方法,其特征在于采用全骨髓培養(yǎng)法,以多次更換培養(yǎng)液的方式逐步去除未貼壁的細胞,細胞呈明顯克隆樣生長后,酶解使其重新懸浮,流式細胞儀富集sca-1(+)、lineage(-)及CD45(-)的亞群細胞,即得極小類胚胎樣干細胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法,其特征在于全骨髓培養(yǎng)法的培養(yǎng)時間為5-6天,更換培養(yǎng)液的次數(shù)為3次。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法,其特征在于全骨髓培養(yǎng)法的培養(yǎng)時間為5-6天,培養(yǎng)液的更換次數(shù)為3次,第1次為24小時,以后每隔兩天清洗一次。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的方法,其特征在該方法的具體步驟如下:

a.取出全骨髓細胞接種到塑料培養(yǎng)瓶中,置于37℃、含5%CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng);

b.接種后24小時初次更換培養(yǎng)液,去除非貼壁細胞,之后每兩天更換一次培養(yǎng)液,共計更換3次;

c.全骨髓細胞培養(yǎng)5天,細胞呈明顯克隆樣生長后,加入0.25%胰酶-0.02%EDTA液使所有細胞重新懸浮;

d.將細胞懸液加至熒光素標記抗體稀釋液混勻,避光,置冰上孵育30min;

e.清洗未結(jié)合的抗體,離心,重復兩次,然后重新懸浮;

f.以流式細胞儀分選sca-1(+)/lin(-)/CD45(-)亞群細胞,即極小類胚胎樣干細胞。

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