[發(fā)明專利]nisin-rbLF-N融合基因以及表達該融合基因的畢赤酵母工程菌

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010258798.1
• 申請日: 2010-08-20
• 公開（公告）號: CN101974546A
• 公開（公告）日: 2011-02-16
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃昆侖;許文濤;羅云波;田洪濤;田文瑩;袁曉宇;王海峰
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/62
• 分類號: C12N15/62;C12N15/81;C12N1/19;C12P21/00;C12R1/84
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種高效表達重組nisin-rbLF-N融合基因的畢赤酵母工程菌、其構(gòu)建方法及誘導(dǎo)培養(yǎng)方法。

背景技術(shù)

乳酸鏈球菌素(Nisin)是一種高效、無毒的天然防腐劑，也是唯一一種可作為防腐劑應(yīng)用于食品的細菌素。Nisin又稱乳酸鏈球菌肽，是由乳酸鏈球菌產(chǎn)生的一種多肽物質(zhì)，它能有效抑殺嗜熱脂肪芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、李斯特氏菌、肉毒梭菌、乳酸菌等各種革蘭氏陽性菌的營養(yǎng)細胞和芽孢。加入食品中，可大大地降低食品的滅菌溫度、縮短食品滅菌時間，使食品保持原有營養(yǎng)成份、風(fēng)味、色澤，同時還可節(jié)約大量能源?？蓮V泛應(yīng)用于肉制品、乳制品、植物蛋白食品、罐裝食品、果汁飲料及經(jīng)熱處理密閉包裝食品的防腐保鮮，同時也可應(yīng)用于化妝品和醫(yī)療保健品等領(lǐng)域。

乳鐵蛋白肽(LFcin)是乳鐵蛋白在酸性環(huán)境下經(jīng)胃蛋白酶作用N端釋放的一段多肽，廣泛存在于動物的乳汁、體液、淚液、唾液、血漿、中性粒細胞及多種組織中。具有抗菌、抗病毒、抗氧化、消炎、抗癌、調(diào)節(jié)機體免疫、促進骨細胞生長等多種生物功能，在眾多的功能中，抗菌功能是最引人注目的，而對真核細胞幾乎沒有毒性。且牛乳鐵蛋白氨基末端多肽(rbLF-N)的抗菌活性較其它的乳鐵蛋白肽活性高具有很好的應(yīng)用前景。

Nisin應(yīng)用前景廣闊，但也存在局限性，如不能夠抑制G-菌、酵母菌以及霉菌，在中性及堿性環(huán)境中溶解度低、不穩(wěn)定而且抗菌效果大大降低等，因此擴大nisin抗菌譜的研究不僅具有理論價值，而且具有十分重要的應(yīng)用價值。

本發(fā)明針對乳鏈菌肽(nisin)抑菌譜窄的缺點，選擇抗菌譜較廣且具有較強抗性的牛乳鐵蛋白氨基末端多肽(rbLF-N)為材料，構(gòu)建融合基因nisin-rbLF-N，并在畢赤酵母GS115宿主中進行表達，獲得具有較廣抗菌譜的融合蛋白。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種能在畢赤酵母中高效表達的重組nisin-rbLF-N融合基因。

本發(fā)明的另一目的是提供一種含有所述重組nisin-rbLF-N融合基因的表達載體。

本發(fā)明的再一目的是提供能夠高效表達重組nisin-rbLF-N融合基因的畢赤酵母工程菌及其構(gòu)建方法。

本發(fā)明的進一步目的是提供所述畢赤酵母工程菌的誘導(dǎo)培養(yǎng)方法。

為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種融合基因，其含有編碼乳酸鏈球菌素的nisin基因和編碼牛乳鐵蛋白氨基末端多肽的rbLF-N基因。

前述的融合基因為Nisin-rbLF-N，其具有Seq?ID?No.1所示的核苷酸序列或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個核苷酸形成的具有編碼同等功能蛋白質(zhì)的核苷酸序列。

本發(fā)明還提供含有上述融合基因的載體。優(yōu)選地，其出發(fā)載體為pPIC9K。

本發(fā)明還提供含有上述載體的工程菌。優(yōu)選地，所述工程菌為畢赤酵母。更優(yōu)選地，其為畢赤酵母GS115。

本發(fā)明另外提供構(gòu)建上述畢赤酵母GS115工程菌的方法。

根據(jù)密碼子的簡并性，設(shè)計并合成適于在BL21中表達的nisin基因，并在5’端和3’端設(shè)計EcoR?I和BamH?I酶切位點，將優(yōu)化后的nisin基因克隆于pMD19-T載體。根據(jù)目的序列分別設(shè)計引物。在上游引物設(shè)計酶切位點BamH?I(下劃線標(biāo)記)和保護堿基。

上游引物F1：5’-CGGGATCCATGAGCACCAAAGAT-3’；

下游引物R1：5’-TTTGCTCACATGAATGCTGC-3’。

根據(jù)牛乳鐵蛋白cDNA序列，設(shè)計引物。在上游引物設(shè)計與nisin互補配對的序列(下劃線標(biāo)記)，下游引物設(shè)計酶切位點EcoR?I(下劃線標(biāo)記)、終止密碼子和保護堿基。

上游引物F2：5’-GCAGCATTCATGTGAGCAAATGTCTGGCTGCCCCGA-3；

下游引物R2：5’-CGGAATTCTTACCGGATACATGCCAAGGC-3’。