[發(fā)明專利]一種凡納濱對蝦fx5微衛(wèi)星DNA標(biāo)記鑒定fx5遺傳變異圖譜的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010258780.1
• 申請日: 2010-08-20
• 公開（公告）號: CN101967520A
• 公開（公告）日: 2011-02-09
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李朝政;呂玲;翁少萍;何建國
• 申請（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛(wèi)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于分子生物學(xué)DNA標(biāo)記技術(shù)與應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及海洋經(jīng)濟(jì)動物對蝦屬凡納濱對蝦（Litopenaeus?vannamei）fx5微衛(wèi)星DNA標(biāo)記鑒定fx5微衛(wèi)星遺傳變異圖譜的方法。

背景技術(shù)

凡納濱對蝦（Litopenaeus?vannamei），俗稱南美白對蝦（Penaeus?vannamei），屬節(jié)肢動物門（Arthropoda）、甲殼綱（Crustacea）、十足目（Decapoda）、游泳亞目（Natantia）、對蝦科（Penaeidae）、對蝦屬（Penaeus）、Lito-penaeus亞屬，是廣溫廣鹽性熱帶蝦類，是目前世界上三大養(yǎng)殖對蝦（中國對蝦、斑節(jié)對蝦、凡納濱對蝦）中單產(chǎn)量最高的蝦種，在對蝦漁業(yè)及養(yǎng)殖業(yè)中占有重要地位。

1988年7月，凡納濱對蝦由中國科學(xué)院海洋研究所從美國夏威夷引進(jìn)我國，1992年8月人工繁殖獲得了初步的成功，1994年通過人工育苗獲得了小批量的蝦苗，1999年深圳天俊實業(yè)股份有限公司與美國三高海洋生物技術(shù)公司合作，引進(jìn)美SPF凡納濱對蝦種蝦和繁育技術(shù)，成功地培育出了SPF凡納濱對蝦苗。至此，凡納濱對蝦在我國被廣泛養(yǎng)殖。

近年來，凡納濱對蝦（Penaeus?vannamei）在我國不論是海水，還是低鹽度海水及淡水中養(yǎng)殖都取得了一定的進(jìn)展。目前，凡納濱對蝦已是我國養(yǎng)殖對蝦的絕對優(yōu)勢品種。2007年，我國凡納濱對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量101萬噸，占我國對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量的80?%?,?同年，我國對蝦養(yǎng)殖產(chǎn)量126萬噸，占世界對蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量的?37?%。但病害和養(yǎng)殖使得凡納濱對蝦資源迅速衰減，尤其自90年代蝦病爆發(fā)以來，凡納濱對蝦養(yǎng)殖業(yè)受到重挫，蝦病的流行使抗病品系選育成為必要和需要解決的問題。

本發(fā)明做出之前，國內(nèi)外有類似的研究報告，國內(nèi)中科院海洋研究所徐鵬等（2001）發(fā)表的《中國對蝦微衛(wèi)星DNA的篩選》，張留所（2006）等發(fā)表的《凡納濱對蝦分子標(biāo)記篩選、連鎖圖譜構(gòu)建和QTL定位》國外Franklin?Pérez等（2005）在凡納濱對蝦中找到了112對微衛(wèi)星，目前，利用微衛(wèi)星標(biāo)記在凡納濱對蝦多態(tài)性圖譜的構(gòu)建、特異性遺傳標(biāo)記等方面的應(yīng)用尚未報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了簡便快速的鑒定凡納濱對蝦fx5遺傳標(biāo)記基因座位的遺傳變異圖譜，豐富現(xiàn)有的凡納濱對蝦微衛(wèi)星標(biāo)記，尋找更多的多態(tài)性好、穩(wěn)定性高的微衛(wèi)星標(biāo)記，提供了一種凡納濱對蝦fx5微衛(wèi)星DNA標(biāo)記鑒定fx5遺傳變異圖譜的方法。

本發(fā)明是通過以下方案實現(xiàn)的：一種凡納濱對蝦fx5微衛(wèi)星DNA標(biāo)記鑒定fx5遺傳變異圖譜的方法，其特征在于包括以下步驟：先提取凡納濱對蝦基因組并稀釋備用，再利用凡納濱對蝦fx5微衛(wèi)星DNA核心序列，在其序列兩端設(shè)計特異性引物；然后使用該引物對凡納濱對蝦不同群體或者群體內(nèi)個體的基因組DNA進(jìn)行PCR擴增，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠檢測；利用產(chǎn)物出現(xiàn)的條帶銀染顯色后進(jìn)行分析，確定每個個體的基因型，從而獲得凡納濱對蝦在fx5遺傳標(biāo)記基因座位的多態(tài)性遺傳變異圖譜（如圖1所示）。

提取凡納濱對蝦基因組DNA，將其稀釋成50ng/ul，每個反應(yīng)加入1ul，反應(yīng)總體積為20ul。

fx5微衛(wèi)星DNA序列的特異性引物核苷酸序列分別為：正鏈?5’-?TCTGGGACAATTTTGAGGATG?-3’，負(fù)鏈?5’-GTCATCATCATTTCCATCTTTA?-3’，退火溫度為50℃。

其PCR反應(yīng)加樣參數(shù)：正反向引物各為0.2?uM,?0.2?mM?dNTP,?1*PCR?Buffer,?2.0?mM?Mg²⁺,?0.6?U?Taq酶，50?ng?DNA模板，用雙蒸水補足到20ul。使用該引物的時設(shè)置PCR程序參數(shù)為：94℃預(yù)變性5分鐘；然后94℃變性?30秒，50℃退火1分鐘，72℃延伸?1?分鐘，重復(fù)這個循環(huán)35次；之后延伸5?分鐘，4?℃保存。