[發(fā)明專利]一種檢測乳酒念珠菌的DNA探針、基因芯片及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010258285.0
• 申請日: 2010-08-18
• 公開（公告）號: CN102031297A
• 公開（公告）日: 2011-04-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李國輝
• 申請（專利權(quán)）人: 李國輝
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京集佳知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11227
• 代理人: 馮瓊;李玉秋

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測乳酒念珠菌的DNA探針、基因芯片及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

侵襲性真菌感染是真菌入侵人體而導(dǎo)致血液感染、各個臟器感染或全身播散的嚴(yán)重感染。近20年來侵襲性真菌感染的發(fā)病呈明顯增長趨勢，這與大量應(yīng)用廣譜抗生素、抗癌放療、化療以及其他免疫抑制劑、類固醇藥物、器官移植、靜脈插管和各種侵襲性操作有關(guān)。

侵襲性真菌感染主要的致病真菌有念珠菌屬、曲霉屬、隱球菌屬等條件致病真菌，還有組織胞漿菌、皮炎芽生菌、孢子絲菌等地方流行性致病真菌。不同環(huán)境下，感染的真菌種類不同。侵襲性真菌感染早期沒有特異性表現(xiàn)，所以很容易被掩蓋，病死率很高。

目前臨床常用的檢測真菌的技術(shù)主要有：

(一)鏡檢及培養(yǎng)、鑒定：如六胺銀染色、PAS染色、銀氨G-S染色法、10％KOH法以及真菌培養(yǎng)法是臨床最常用的鑒定手段，但直接鏡檢特異性差、敏感性不足，不能鑒定出真菌種類。真菌培養(yǎng)雖能鑒定真菌種類，但培養(yǎng)條件苛刻，培養(yǎng)時間長，假陰性高，敏感性不足，無法輔助臨床治療。

(二)免疫學(xué)方法：免疫學(xué)方法的基本原理是利用抗原與抗體的特異結(jié)合，來達(dá)到相互間的特異探察。該法主要用于檢測真菌的抗原、抗體、代謝產(chǎn)物及細(xì)胞成分。能根據(jù)真菌抗原性的不同將真菌分類。但抗體的特異性限制了該項(xiàng)技術(shù)的發(fā)展。

免疫組化、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫印跡法及凝集反應(yīng)都是基于免疫學(xué)方法檢測真菌的手段，但目前廣泛應(yīng)用于臨床的僅有G試驗(yàn)，G試驗(yàn)檢測的是真菌的細(xì)胞壁成分：(1，3)-β-D-葡聚糖，人體的吞噬細(xì)胞吞噬真菌后，能持續(xù)釋放該物質(zhì)，使血液及體液中含量增高(淺部真菌感染無類似現(xiàn)象)。適用于除隱球菌和接合菌外的所有深部真菌感染的早期診斷，尤其是念珠菌和曲霉菌，但不能確定菌種。臨床應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)有諸多假陽性可能，例如：

(1)使用纖維素膜進(jìn)行血透標(biāo)本或患者暴露于紗布或其他含有葡聚糖的材料；

(2)靜脈輸注免疫球蛋白、白蛋白、凝血因子或血液制品；

(3)鏈球菌血癥；

(4)操作者處理標(biāo)本時存在污染。

另外，使用多糖類抗癌藥物、放化療造成的粘膜損傷導(dǎo)致食物中的葡聚糖或定植的念珠菌經(jīng)胃腸道進(jìn)入血液等也可能造成假陽性。

(三)分子生物學(xué)技術(shù)：

包括原位雜交、聚合酶鏈反應(yīng)、DNA中G+C?mol％含量測定、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)分析、限制性內(nèi)切酶多態(tài)性分析(RFLP)等，但上述技術(shù)均耗時耗力，不具有高通量的特點(diǎn)，不能用少量的樣本快速同時檢測多種可能存在的真菌，因此多局限于實(shí)驗(yàn)室研究，尚不能真正應(yīng)用于臨床。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種檢測乳酒念珠菌的DNA探針，具有SEQID?No.1所示序列，其與乳酒念珠菌DNA特異性結(jié)合，檢測乳酒念珠菌靈敏度高。

本發(fā)明所述DNA探針可廣泛應(yīng)用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如與以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的核酸雜交技術(shù)結(jié)合，進(jìn)行生物學(xué)分析或臨床診斷。

本發(fā)明結(jié)合基因芯片技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)小樣本、高通量、特異、快速、自動化檢測乳酒念珠菌的目的。本發(fā)明提供的一種用于真菌檢測的基因芯片，通過將特異性寡核苷酸探針固定在固相載體表面形成，所述寡核苷酸探針包含具有SEQ?ID?No.1所示序列的DNA探針。探針、引物與真菌目的基因之間的關(guān)系如表1所示。

表1.本發(fā)明所述基因芯片所使用的引物及探針

作為優(yōu)選，所述固相載體選自硝酸纖維素膜、尼龍膜、聚苯乙烯、玻璃片、硅片、微粒和塑料片。

本發(fā)明的基因芯片所采用的固相載體選自任何可用于制備基因芯片的材料，包括但不限于硝酸纖維素膜、尼龍膜、聚丙乙烯、玻璃片、硅片、微粒和塑料片。所述的固相載體經(jīng)不同的化學(xué)修飾后，在其表面帶有可以固定核酸分子的活性基團(tuán)，這些基團(tuán)包括但不限于氨基(-NH2)、醛基(-CHO)、羧基(-COOH)和巰基(-SH)。

本發(fā)明所述基因芯片在所述固相載體上連接針對乳酒念珠菌的特異性核酸探針，所述探針可以為單鏈或雙鏈DNA分子，其在適當(dāng)?shù)臈l件下可以與乳酒念珠菌基因特異性雜交。所述探針可以通過DNA自動合成或PCR擴(kuò)增而獲得。所述探針在其與載體連接的一端可以選擇性地添加一個目的在于增加探針的空間活動性以利于雜交的連接臂。