[發明專利]恩諾沙星半抗原、人工抗原和抗體及其制備方法和應用

有效

• 申請號: 201010256954.0
• 申請日: 2010-08-17
• 公開（公告）號: CN101962359A
• 公開（公告）日: 2011-02-02
• 發明（設計）人: 孫遠明;張挺;雷紅濤;沈玉棟;楊金易;王弘
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: C07D215/56
• 分類號: C07D215/56;C07K14/765;C07K14/77;G01N33/577
• 代理公司: 廣州粵高專利商標代理有限公司 44102
• 代理人: 林麗明

技術領域

本發明屬于食品安全技術領域。具體涉及恩諾沙星半抗原、人工抗原和抗體的制備方法及應用。

背景技術

恩諾沙星(Enrofloxacin，EF)，其分子式為C₁₉H₂₂FN₃O₃，分子量為359.40，微黃色或淡橙黃色結晶性粉末，無臭，味微苦；遇光色漸變為橙紅色，其結構式為式(1)所示：

恩諾沙星為第三代喹諾酮類(FQs)的典型代表之一，具有抗菌譜廣、毒副作用小、血藥濃度高、半衰期長、制劑形式多樣、藥效價格比高等特點，對各種革蘭氏陰性和陽性菌均具有強大的抑菌作用，與青霉素、頭孢菌素和氨基類藥物均無交叉耐藥性等特點，對于治療炭疽熱病癥具有特效作用。

FQs藥物因其能抑制細菌DNA螺旋酶、抗菌譜廣、高效、低毒、組織穿透力強，抗菌作用是磺胺類藥的近千倍，加之系化學合成藥物，價格低廉，故在醫學和獸醫學中很快取得廣泛應用，尤其在水產養殖中成為最重要的抗感染藥物之一。FQs藥物對動物體以及人體的絕大部分器官和組織都有不同程度的不良反應：由于FQs藥物呈脂溶性，可通過血腦屏障進入腦組織，抑制γ-氨基丁酸(GABA)與其受體結合而產生神經系統反應。故以神經系統的損傷最為常見，其次是皮膚及其附件的損傷。多數不良反應癥狀較輕，且可逆，但也有較重甚至危及生命的。動物實驗表明，FQs藥物可引起幼畜關節炎、跟鍵炎，也能引起過敏性休克，惡心、嘔吐，靜脈炎等癥狀以及某些潛在的致癌性質，同時由于致病菌產生耐藥性，恩諾沙星藥物的殘留問題已引起廣泛關注。美國和歐盟規定在禽食用組織中方的最高殘留限量為恩諾沙星和恩諾沙星為30μg/Kg；我國農業部標準NY5070-2001《無公害食品水產品中漁藥殘留限量》規定恩諾沙星殘留限量為50μg/Kg。

目前，對畜禽水產品中恩諾沙星殘留的檢測主要采用高效液相色譜法(HPLC)、氣相等儀器檢測方法。然而應用儀器方法時，其靈敏度受樣品的凈化、濃縮等步驟的影響很大，測定方法存在復雜、繁瑣、檢測通量小、需要專業人員和專業技能、檢測成本昂貴等缺陷，不能實現大批量樣品的快速檢測分析。因此，有必要研制更加簡單快捷方便的檢測方法。

免疫檢測方法，是目前食品安全快速檢測的重要方法之一，檢測成本很低，使用簡單，適合大量樣品的篩選檢測，已經在食品安全檢測中發揮了重要作用。人工抗原的合成是半抗原物質免疫分析方法建立的的關鍵，對于恩諾沙星，因為其本身含有羧基，不需要衍生，因此目前都是直接利用該羧基和蛋白質連接。譬如，蔡勤仁等發表了論文“恩諾沙星單克隆抗體的制備及鑒定”(中國農業科學，2004)，采用碳二亞胺法，直接偶聯羧基和蛋白質的氨基合成了恩諾沙星人工抗原；唐宏等公開了一種專利“恩諾沙星單克隆抗體及應用(申請號200910027793.5)”，采用碳二亞胺法將恩諾沙星和載體蛋白BSA、HSA及OVA偶聯。

但是，現有技術獲得的恩諾沙星抗體的特異性和識別力不夠。

發明內容

本發明的一個目的是填補恩諾沙星現有檢測技術的不足，提供一種恩諾沙星人工半抗原、人工抗原和特異性單克隆抗體。

本發明的另一個目的是提供所述恩諾沙星人工半抗原、人工抗原和特異性單克隆抗體的制備方法。

本發明還有一個目的是提供所述恩諾沙星人工半抗原、人工抗原和特異性單克隆抗體的應用。

本發明的目的通過以下技術方案予以實現：

提供一種恩諾沙星人工半抗原、人工抗原和特異性單克隆抗體，所述恩諾沙星人工半抗原具有式(II)所示分子結構：

其中，n為-CH₂基團數目，n＝4或6，優選n＝4。

所述恩諾沙星人工抗原，具有式(III)所示分子結構：

其中，n為-CH₂基團數目，n＝4或6，優選n＝4。

本發明提供了所述恩諾沙星半抗原的制備方法，是以恩諾沙星與氨基丁酸(H₂NCH₂CH₂CH₂COOH)或氨基己酸(H₂NCH₂(CH₂)₄COOH)在NHS、DDC和DMF存在條件下反應生成含4個或6個碳原子手臂的半抗原。

恩諾沙星半抗原合成路線(以生成結構式中n取值為4為例)：

本發明所述恩諾沙星半抗原的制備包括以下步驟：