[發明專利]一種快速確定鴨疫里默氏桿菌培養物中細菌數量的方法

有效

• 申請號: 201010256430.1
• 申請日: 2010-08-19
• 公開（公告）號: CN101936890A
• 公開（公告）日: 2011-01-05
• 發明（設計）人: 程安春;汪銘書;朱德康;陳孝躍
• 申請（專利權）人: 四川農業大學實驗動物工程技術中心
• 主分類號: G01N21/33
• 分類號: G01N21/33;C12Q1/06
• 代理公司: 暫無信息
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技術領域

本發明涉及鴨疫里默氏桿菌的細菌計數，特別涉及利用紫外分光光度計來檢測鴨疫里默氏桿菌培養物中鴨疫里默氏桿菌細菌數量的方法。

背景技術

鴨傳染性漿膜炎是發生于家鴨、鵝、火雞和多種禽類的一種接觸性傳染病，又稱鴨疫里默氏桿菌病、鴨疫巴氏桿菌病、鴨敗血癥、鴨疫綜合癥、鴨疫敗血癥和新鴨病，其病原為鴨疫里默氏桿菌(Riemerellaanatipestifer，RA)。該病呈急性敗血癥或慢性感染，臨床上主要表現為咳嗽、喘氣、下痢、眼鼻分泌物增多、共濟失調和頭頸震顫，少數慢性病例出現頭頸歪斜等癥狀；典型病變為纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎和干酪性輸卵管炎。該病一年四季均可發生，以冬季發病嚴重，主要經污染的飼料、飲水、飛沫等傳播；1-8周齡的鴨高度敏感，尤以2-3周齡的雛鴨發病率較高，可達90％；死亡率受多種因素的影響，差別較大，常為10-20％，但也有的高達60-75％。應激因素如飼養密度過大、通風不暢、衛生條件差、氣候突變等，可誘發該病的發生，死亡率大大提高；耐過鴨可表現神經癥狀，生長發育緩慢、消瘦，飼料報酬下降，嚴重影響生產成績，造成嚴重的經濟損失。

鴨傳染性漿膜炎是目前對世界各國養鴨業造成危害最為嚴重的傳染病之一，在世界范圍內分布，幾乎在所有采用集約化養鴨生產的國家都有發現，給世界養鴨業造成了巨大的經濟損失。我國是一個養鴨大國，養鴨業在我國的農業經濟中占有著重要的地位，也是人們生活所需肉蛋的重要來源之一，鴨傳染性漿膜炎在我國各養鴨地區的流行較嚴重，是我國養鴨場(特別是商品鴨場)最難于對付、造成養鴨業經濟損失的最主要傳染病之一，加之RA的耐藥性逐漸增強，給我國養鴨業造成了巨大經濟損失。

由于鴨傳染性漿膜炎給養鴨業帶來嚴重的經濟損失，有關鴨疫里默氏菌的研究引起了越來越多的關注。其中鴨疫里默氏菌的細菌計數是鴨疫里默氏菌及鴨傳染性漿膜炎防治有關研究的基礎，如研究鴨疫里默氏菌的培養條件、增殖特性、致病劑量、疫苗含菌量等等均離不開鴨疫里默氏菌的細菌計數。細菌計數的方法有計數器測定法、電子計數器計數法、平板菌落計數法、比濁法、測定細胞重量法、測定細胞總氮量或總碳量、顏色改變單位法等，其中比濁法和菌落計數法可滿足絕大多數細菌的計數且也是最常用的方法。

菌落計數法是根據每個活的細菌能培養長出一個菌落的原理設計的，不需要特殊儀器，操作簡單，測定時取一定容量的菌懸液作一系列的倍比稀釋，然后將定量的稀釋液進行平板培養，根據培養出的菌落數，可算出培養物中的活菌數，此法靈敏度高，是一種檢測活菌數的好方法，但該法費時，至少需24小時才能出結果，且需判斷選擇好適宜的稀釋度(一般選取菌落數在30～300之間的平板進行計數，過多或過少均不準確)，對鴨疫里默氏菌來說，由于其培養條件較苛刻(如需特殊培養基或加入血、CO₂等)，因此其操作的復雜性、花費及時間等均增大。

比濁法是根據菌懸液的透光量間接地測定細菌的數量。細菌懸浮液的濃度在一定范圍內與透光度成反比，與光密度成正比，所以，可用光電比色計測定菌液，用光密度(OD值)表示樣品菌液濃度。但光密度或透光度除了受菌體濃度影響之外，還受細胞大小、形態、培養液成分以及所采用的光波長等因素的影響，且通常只能檢測含有大量細菌的懸浮液，得出相對的細菌數目，對顏色太深的樣品或組織樣品等，不能用此法測定，但此法簡便快捷。比濁法測定細菌的數量主要的關鍵是如何排除樣品中的干擾物、所采用的光波波長的確定和測定的OD值與細菌數量間對應關系，否則只能判斷出相對的細菌數目而不能確定出準確的細菌數目。目前，利用紫外分光光度計來測定鴨疫里默氏桿菌數量還需摸索。

發明內容

本發明的目的在于提供一種快速確定鴨疫里默氏桿菌培養物中鴨疫里默氏桿菌數量的方法，涉及所用的檢測儀器種類、檢測過程中所采用的光波波長、檢測步驟及OD值與鴨疫里默氏桿菌培養物中鴨疫里默氏桿菌數量間的換算關系。

本發明采用如下技術方案：

一種快速確定鴨疫里默氏桿菌培養物中細菌數量的方法，包括以下步驟：①取樣；②離心洗滌：以3000～5000轉/分鐘離心5-10分鐘后，用生理鹽水連續離心洗滌3次，每次離心洗滌5-10分鐘，轉速3000～5000轉/分鐘；③稀釋：用生理鹽水作N倍稀釋；④檢測：于紫外分光光度計下測定560nm處OD值；⑤計算：按照以下公式計算鴨疫里默氏桿菌的數量，含菌總數(CFU/ml)＝OD_560nm值×N×2×10⁹CFU/ml。

所述的方法，所述取樣步驟中，液體培養物或菌液直接定量取樣。