[發(fā)明專利]一種產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010256208.1
• 申請(qǐng)日: 2010-08-18
• 公開（公告）號(hào): CN101948767A
• 公開（公告）日: 2011-01-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陸兆新;李遠(yuǎn)宏;呂鳳霞;別小妹;鄒曉葵
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/20
• 分類號(hào): C12N1/20;C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/46
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 張素卿

1.一種產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選方法，其特征為：

1)乳酸菌的富集培養(yǎng)

選擇富含乳酸菌食品新鮮牛奶、發(fā)酵乳制品、發(fā)酵肉制品、發(fā)酵蔬菜制品或發(fā)酵谷物為富集樣品，加入到脫脂牛乳或MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行富集培養(yǎng)，25～40℃靜置培養(yǎng)24～48h，富集培養(yǎng)液；

2)乳酸菌的初步分離純化

取上述富集培養(yǎng)液進(jìn)行10梯度倍比梯度稀釋成10^-4、10^-5、10^-6的稀釋菌液，涂布于MRS平板上，于30℃培養(yǎng)48h，挑取肉眼可見、生長較快、單個(gè)有溶鈣圈的菌落分離并純化，根據(jù)菌落特征進(jìn)行初步歸類，將革蘭氏染色陽性、無芽孢、接觸酶陰性菌株作為進(jìn)一步篩選的乳酸菌疑似菌株，并將其編號(hào)、保存；

3)產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選

將上述分離純化后的菌種接種于MRS培養(yǎng)基中，待菌體生長達(dá)到穩(wěn)定期時(shí)，離心收集菌體，加入0.5～3倍培養(yǎng)液體積的滅菌生理鹽水洗滌菌體2～4次，取濕菌體0.1～1g，懸浮于5～50mL含有5～100mM的L-谷氨酸或L-谷氨酸鈉溶液的0.2mol·L^-1醋酸-醋酸鈉緩沖體系中，在pH3.2～8.0，20～80℃下進(jìn)行攪拌反應(yīng)1～24h，反應(yīng)結(jié)束后，將混合液離心后，取上清進(jìn)行紙層析分析，所述的紙層析分析方法為，展開劑組成：正丁醇∶冰乙酸∶水體積比＝4∶1∶3，內(nèi)含質(zhì)量濃度為0.4g/100mL的茚三酮，以GABA標(biāo)準(zhǔn)品做參比，待測(cè)樣品點(diǎn)樣5μL，采用新華一號(hào)層析紙展開后于90℃下烘干顯色20min；

4)產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的判斷

如果紙層析分析反應(yīng)體系中存在與GABA標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)遷移率R_f一致的茚三酮顯色斑點(diǎn)，則含有γ-氨基丁酸，即為即為篩選得到產(chǎn)γ-氨基丁酸的乳酸菌。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述一種產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的篩選方法，其篩選得到產(chǎn)γ-氨基丁酸的乳酸菌鑒定方法為：

(1)形態(tài)學(xué)鑒定

培養(yǎng)特征、細(xì)胞形態(tài)及其染色特性、特殊的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、運(yùn)動(dòng)性；

(2)生理生化鑒定

糖醇類發(fā)酵試驗(yàn)，耐鹽試驗(yàn)，不同溫度試驗(yàn)；

(3)16S?rDNA序列分析進(jìn)行菌株的鑒定

采用細(xì)菌總DNA提取試劑盒提取基因組DNA，采用細(xì)菌的16S?rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR結(jié)束后，吸取PCR產(chǎn)物5μL與1μL?loading?buffer混合，用1.0％的瓊脂糖凝膠電泳，電壓為100V，電泳結(jié)束后用溴化乙錠EB染色20～30min，拍照；

PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后測(cè)序，將16S?rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的核苷酸序列進(jìn)行同源性分析；

通過以上形態(tài)學(xué)特征、生理生化特征和16S?rDNA序列測(cè)定并進(jìn)行同源性比對(duì)分析，對(duì)產(chǎn)γ-氨基丁酸的乳酸菌進(jìn)行鑒定。