[發(fā)明專利]特異性抑制SET蛋白表達的shRNA表達載體及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010255722.3
• 申請日: 2010-08-17
• 公開（公告）號: CN101948859A
• 公開（公告）日: 2011-01-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉建軍;蔣英芝;楊細(xì)飛;李杰;周麗
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市疾病預(yù)防控制中心
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63;C12N15/867;C12N15/113;C12N15/66;A61K48/00;A61P1/16;A61P35/00;A61P43/00
• 代理公司: 深圳市科吉華烽知識產(chǎn)權(quán)事務(wù)所 44248
• 代理人: 胡吉科

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是涉及一種可以可在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達的，能特異性抑制SET蛋白表達的shRNA表達載體及其該載體的表達方法。

背景技術(shù)

癌蛋白SET又稱I2PP2A、TAF-Iβ，在細(xì)胞中廣泛存在，是體內(nèi)主要的絲-蘇氨酸蛋白磷酸酶2A(protein?phosphatase?2A，PP2A)的胞內(nèi)抑制蛋白，具有特異性、非競爭性和熱穩(wěn)定性，同時SET也是組蛋白分子伴侶。其在急性未分化型白血病中首次被鑒定，近年來的研究表明，SET是一個多功能蛋白，涉及細(xì)胞凋亡、腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)、核小體裝配、組蛋白結(jié)合等方面。Madeira?A等報道在Alzheimer’s疾病中SET蛋白參與了神經(jīng)元凋亡過程，為此疾病機理提供了新的線索；PP2A活性的缺失或改變與腫瘤發(fā)生有一定聯(lián)系，許多細(xì)胞毒素的促腫瘤作用與抑制PP2A的活性有關(guān)，PP2A被認(rèn)為可能是一個潛在的腫瘤抑制因子。而SET蛋白作為PP2A的胞內(nèi)抑制蛋白，其與腫瘤發(fā)生也密切相關(guān)，如Wilm’s腫瘤中SET?mRNA和蛋白表達都顯著上升，通過癌蛋白SET的磷酸化可促進前列腺癌細(xì)胞生長，肝細(xì)胞癌變中觀察到I2PP2A/SET基因表達上調(diào)，PP2A活性受抑制；SET蛋白能誘導(dǎo)原癌基因C-Jun的表達和影響轉(zhuǎn)錄因子AP-1的活性，同時也能增強激活蛋白-1(activator?protein-1)的轉(zhuǎn)錄活性；SET作為組蛋白分子伴侶，能抑制組蛋白和核小體的乙酰化，從而導(dǎo)致組蛋白依賴性轉(zhuǎn)錄的沉默和DNA去甲基化激活受阻。

三氯乙烯(Trichloroethylene，TCE)為不飽和鹵代脂肪羥類化學(xué)物，是電子、制革和五金行業(yè)常用的有機清洗溶劑，經(jīng)吸入和皮膚接觸后可引起肝臟、腎臟、心臟及皮膚的損害。近年來，三氯乙烯中毒事件呈上升趨勢，死亡事件也時有報道。三氯乙烯中毒主要表現(xiàn)為藥疹樣皮炎，但肝臟功能損害情況亦相當(dāng)嚴(yán)重。劉建軍等利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)研究三氯乙烯刺激肝細(xì)胞后蛋白質(zhì)差異表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中的SET差異蛋白在TCE低劑量時表達上調(diào)，并且隨著TCE劑量的增加，其表達繼續(xù)上升。

自1998年Fire等人發(fā)現(xiàn)RNA干擾(RNA?interference，RNAi)現(xiàn)象以來，RNAi技術(shù)已被證實是一種特異、高效、經(jīng)濟的抑制基因表達的手段而受到極大的重視和歡迎。2001年，RNAi技術(shù)被成功應(yīng)用于哺乳動物細(xì)胞，其應(yīng)用前景更加誘人，已經(jīng)成為疾病研究和治療的熱點。研究者們可以利用這項技術(shù)對目標(biāo)基因或蛋白質(zhì)進行特異性表達沉默，通過觀察其表達被抑制的細(xì)胞或者生物體的從形態(tài)到各項生理生化指標(biāo)的變化，對該基因或蛋白質(zhì)的功能及參與的信號網(wǎng)絡(luò)進行研究。這比傳統(tǒng)的基因敲除方法要簡單而且方便得多，因此短短幾年，就有了很多突破性的成果，其中研究得最多的是與疾病相關(guān)的一些基因和蛋白。

RNA干擾是與靶基因序列同源的雙鏈RNA(double-stranded?RNA，dsRNA)所誘導(dǎo)的一種特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象(post-transcriptional?gene?silencing，PTGS)。外源性或內(nèi)源性的雙鏈RNA進入細(xì)胞后，在三磷酸腺苷(ATP)依賴性RNA酶III(Dicer，DCR)的作用下被切割成3’端有2個突出堿基的21-23nt長度的小分子干擾RNA(small?interference?RNA，siRNA)；這些siRNA與RNAi特異性酶結(jié)合，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced?silencing?complex，RISC)；而后RISC在siRNA反義鏈的指導(dǎo)下與siRNA同源靶mRNA相結(jié)合，RISC中的重要組成成分Ago-2蛋白在近中點位置將其切割A(yù)，隨后靶mRNA被細(xì)胞內(nèi)RNA酶降解，轉(zhuǎn)錄后的mRNA就不能翻譯出相對應(yīng)的蛋白，而RISC游離出來，尋找新的目標(biāo)分子，從而達到抑制靶基因表達的作用。

現(xiàn)有技術(shù)中，沒有發(fā)現(xiàn)存在可長效穩(wěn)定表達，特異性抑制SET蛋白表達的shRNA表達載體，而且現(xiàn)有的其它shRNA表達載體往往存在轉(zhuǎn)染效率低，干擾效果不穩(wěn)定，載體用量大，而且通常都需要多次瞬時轉(zhuǎn)染等缺陷。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一在于提供一種可以長效穩(wěn)定表達，且能特異性抑制SET蛋白表達的shRNA表達載體，避免多次瞬時轉(zhuǎn)染造成繁瑣流程，能有效地抑制SET蛋白表達，可以用于制備治療SET蛋白表達異常相關(guān)疾病的藥物中，解決現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：