[發明專利]檢測蛋雞FMO3基因多態性的試劑盒及其方法

無效

• 申請號: 201010255561.8
• 申請日: 2010-08-17
• 公開（公告）號: CN101899524A
• 公開（公告）日: 2010-12-01
• 發明（設計）人: 潘玉春;陳強;王起山;張向喆;楊長鎖
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海交達專利事務所 31201
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

1.一種檢測蛋雞FMO3基因多態性的試劑盒，其特征在于，包括：堿基序列如下的正向引物和反向引物：正向引物：5’-CGGTGTTGAATGATGAC-3’反向引物：5’-GCATTTGTAGAGGGTAG-3’；dNTPs；DNA聚合酶及其相應10×PCR緩沖液；限制性核酸內切酶BsrI及其相應的10×酶切緩沖液；

所述的PCR緩沖液為：200mM?Tris-HCl；200mM?KCl；100mM(NH₄)₂SO₄；15mM?MgCl₂；

所述的酶切緩沖液為：100mM?Tris-HCl；100mM?MgCl₂；1mg/ml?BSA。

2.一種如權利要求1所述的試劑盒檢測蛋雞FMO3基因多態性的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)基因組DNA的提取采集雞翅膀根部靜脈血，利用DNA提取試劑盒提取基因組DNA，DNA樣品被稀釋成100ng/μl備用；

(2)利用步驟(1)中提取的基因組DNA為模板進行特異性PCR擴增；

(3)使用限制性內切酶對步驟(2)中的PCR產物進行酶切；

(4)將酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳，對基因型進行判定。

3.如權利要求2所述的檢測蛋雞FMO3基因多態性的方法，其特征是，步驟(2)中PCR擴增反應體系為：雞基因組DNA?100ng、10×PCR緩沖液2.0μl、dNTPs(10mmol/L)混合物0.4μl、Taq?DNA聚合酶(2.5U/μl)0.4μl、正向引物6.0pmol、反向引物6.0pmol、用ddH₂O補充混合液至20.0μl。

4.如權利要求3所述的檢測蛋雞FMO3基因多態性的方法，其特征是，所述20.0μl?PCR擴增反應體系下，94℃預變性5min；后進入循環程序：94℃變性30s、56℃退火30s、72℃延伸45s，共計32個循環；72℃延伸10min。

5.如權利要求2所述的檢測蛋雞FMO3基因多態性的方法，其特征是，所述步驟(2)中使用的特異性引物包括正向引物和反向引物，如下所示：

正向引物：5’-CGGTGTTGAATGATGAC-3’

反向引物：5’-GCATTTGTAGAGGGTAG-3’。

6.如權利要求2所述的檢測蛋雞FMO3基因多態性的方法，其特征是，所述步驟(3)在10.0μlBsrI酶切體系中進行，10.0μlBsrI酶切體系包括：步驟(2)中PCR擴增產物8.5μl、10×酶切緩沖液1.0μl、內切酶BsrI(10U/μl)0.5μl。

7.如權利要求2所述的檢測蛋雞FMO3基因多態性的方法，其特征是，步驟(3)中所述的限制性內切酶為BsrI內切酶。

8.如權利要求2所述的檢測蛋雞FMO3基因多態性的方法，其特征是，步驟(3)中所述的PCR產物包括自5’末端第1034位脫氧核糖核苷酸即T329S位點脫氧核糖核苷酸，根據該位點脫氧核糖核苷酸是野生型A還是突變型T對基因型進行判定：

如果酶切產物為146bp和78bp兩種片段，顯示檢測個體基因型為AA型，為野生型純合體，電泳結果為兩條帶；

如果酶切產物為224bp、146bp和78bp三種片段，顯示檢測個體基因型為AT型，為雜合體，電泳結果為三條帶；

如果酶切產物為224bp一種片段，顯示檢測個體基因型為TT型，為突變型純合體，電泳結果為一條帶。