[發明專利]泛醌類代謝中間產物的發酵生產方法

無效

• 申請號: 201010255510.5
• 申請日: 2010-08-17
• 公開（公告）號: CN101993898A
• 公開（公告）日: 2011-03-30
• 發明（設計）人: 梁如冰;劉建華
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12P7/42
• 分類號: C12P7/42;C12R1/19
• 代理公司: 上海交達專利事務所 31201
• 代理人: 王錫麟;王桂忠

技術領域

本發明涉及一種基因工程技術領域的發酵生產方法，具體是一種利用含條件性重組酶的基因工程菌株進行泛醌類代謝中間產物的發酵生產方法。

背景技術

代謝途徑是生物體生存的核心，包含多個步驟。代謝途徑的許多中間產物都具有巨大的研究與應用價值。一方面，它們可作為底物從分子水平上對相關的代謝酶進行結構與功能的研究，是代謝機理、代謝途徑以及代謝組學的研究基礎。另一方面，許多代謝中間產物本身具有重要的藥用價值，如可用于消化道疾病治療的L-谷氨酰胺和用于肝病治療的腺苷蛋氨酸等都是代謝的中間產物。因此，對代謝中間產物的深入研究，不僅可推進相關代謝途徑的功能與代謝網絡研究，還可能從中分離鑒定出新的具有治療效果的藥物。

目前主要有兩種方法可用于分離代謝中間產物，一是生物合成方法，另一個是化學合成方法。傳統的生物合成方法是利用基因工程的方法，將目標代謝中間產物的下游分解代謝基因敲除，阻斷下游代謝途徑，從而在細胞內累積目標代謝中間產物?；瘜W合成方法是在體外利用化學合成的方法，對已知結構的代謝中間產物進行合成。兩種方法各有利弊，生物合成法分離較困難，產量較低，可累積的產物種類有限，但是成本較低，操作相對簡單；而化學合成方法成本較高，步驟復雜，不可控因素較多，但是產量較高。因此，在對不同種類的代謝中間產物的制備與分離時會采用不同的方法。盡管如此，至今大部分代謝中間產物既不能通過簡單的化學合成方法，也不能利用傳統的生物合成方法進行生產，原因是這些代謝中間產物的結構復雜，化學合成困難；但其形成又涉及到生物體必需的代謝途徑，無法利用傳統的基因敲除策略來累積獲得。

泛醌是參與生物體內電子傳遞、氧化磷酸化及蛋白質二硫鍵形成等生理過程的重要物質，對其合成代謝的研究始終是研究熱點。泛醌類物質作為泛醌合成的中間產物，不僅可以用于研究泛醌及其相關代謝途徑的研究，而且可用于一些疾病，如心臟類疾病的治療，具有很高的藥用價值。研究發現，在大腸桿菌中共九個酶參與從4-羥基苯甲酸起始的泛醌合成途徑；其中，3-八異戊二烯-4-羥苯甲酸是整個途徑中唯一的分支點。在大腸桿菌中，由UbiD和UbiX(3-八異戊二烯基-4-羥基苯甲酸脫羧酶)兩個同工酶催化其下一步代謝(Gulmezian?M，Hyman?KR，Marbois?BN，Clarke?CF，Javor?GT.The?role?of?UbiX?in?Escherichia?coli?coenzyme?Qbiosynthesis.Arch?Biochem?Biophys.2007，467(2)：144-153)。在許多厭氧菌或者兼性厭氧菌中該酶均保守存在，說明其在泛醌合成中具有重要作用。但目前對兩個酶的功能及結構報道極少，原因是該酶的底物，3-八異戊二烯-4-羥苯甲酸，很難獲得。因為(1)3-八異戊二烯-4-羥苯甲酸本身結構復雜，尚無現成的化學合成技術可進行化學合成；(2)3-八異戊二烯-4-羥苯甲酸僅僅是泛醌合成途徑的中間產物，體內累積量很少，無法通過常規的生物發酵法獲得；(3)更重要的是，由于泛醌是細胞生長所必需的因子，直接敲除ubiD和ubiX基因的細菌無法生存，所以傳統的基因改造手段也不能應用。

發明內容

本發明的目的是在于克服現有技術中的不足，提供一種泛醌類代謝中間產物的發酵生產方法。本發明利用含有條件性重組酶的基因工程菌株，可實現對必需途徑中的具有復雜結構的泛醌類代謝中間產物進行生物學發酵生產，操作步驟簡便，成本低廉，無有特殊的儀器要求，產量可達mg/L。

本發明是通過如下技術方案實現的：

本發明利用同源重組技術，敲除大腸桿菌的ubiX基因，構建ubiX缺失菌株UBIX；將條件性重組酶識別序列與篩選標記基因共同插入ubiX缺失菌株的ubiD基因的兩側，構建重組菌株DYUBIF；將帶有條件性重組酶的質粒導入基因工程菌株DYUBIF，獲得基因工程菌株DYUBI，可用于發酵生產泛醌類中間產物——3-八異戊二烯-4-羥苯甲酸；發酵生產工程菌株DYUBI，可獲得目的泛醌類中間產物——3-八異戊二烯-4-羥苯甲酸。

本發明包括如下步驟：

步驟一，利用同源重組技術，構建在目標必需基因兩側帶有條件性重組酶識別位點和正負篩選標記、包含條件性重組酶質粒的基因工程菌株；

步驟二，培養上述基因工程菌株；

步驟三，加入終濃度為L-阿拉伯糖于步驟二的培養物中，誘導；

步驟四，收集步驟三的培養物，處理后進行反向HPLC檢測，獲得目標泛醌合成途徑的中間產物——3-八異戊二烯-4-羥苯甲酸(HP8B)。