[發明專利]斑點叉尾鮰愛德華氏病疫苗的制備方法

無效

• 申請號: 201010255403.2
• 申請日: 2010-08-17
• 公開（公告）號: CN102370975A
• 公開（公告）日: 2012-03-14
• 發明（設計）人: 梁萬文;黃婷;李莉萍;陳福艷;張彬;雷愛瑩;王瑞
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區水產研究所
• 主分類號: A61K39/02
• 分類號: A61K39/02;C12N1/20;A61P31/04;C12R1/01
• 代理公司: 廣西南寧明智專利商標代理有限責任公司 45106
• 代理人: 黎明天

技術領域

本發明涉及一種魚的疾病的預防和防治方法，具體說是涉及斑點叉尾鮰愛德華氏病滅活疫苗的制備方法。

背景技術

斑點叉尾鮰原產于美洲，該魚具有適應廣、食性雜、生長快、肉質鮮嫩、出肉率高、無肌間刺、加工簡單等特點，1984年從美國引入我國養殖，是當前水產養殖業的重要養殖品種之一。隨著全球性海洋捕撈漁業資源的衰退，國際市場對水產養殖產品的需求越來越大。據不完全統計，我國斑點叉尾鮰年產量為10萬噸左右，2009年出口量1.9萬噸，出口額0.7億美元，是我國水產品出口創匯主要品種之一。

近年來隨著片面地重視規模化發展和高產，造成斑點叉尾鮰養殖病害頻頻暴發，其中由鮰愛德華氏菌引起的斑點叉尾鮰腸道敗血癥成了鮰魚養殖業危害最大的傳染病，并且有逐年遞增的趨勢。病害的暴發與隨之帶來的產品安全問題已成為制約我國斑點叉尾鮰產業繼續向前發展的瓶頸。然而，目前缺乏一套行之有效的方案預防和治療該病，藥物只能在早期起到控制病情的輔助性作用，但隨著耐藥和抗藥性的產生和積累，該病的現狀幾乎是“無藥可治可防”。疫苗免疫是預防和控制斑點叉尾鮰愛德華氏菌病最具前景、安全和環保的方法之一，必需及早研制。研究發現，斑點叉尾鮰愛德華氏菌病的流行菌種主要為Edwardsiella?ictaluri。

發明內容

本發明的目的是為了控制斑點叉尾鮰愛德華氏菌病的傳播與爆發，提供一種鮰愛德華氏菌滅活疫苗的制備方法，該方法能有效地預防鮰愛德華氏菌引發的鮰愛德華氏菌病，對養殖斑點叉尾鮰具有保護作用。

本發明采取的技術方案是：

本發明斑點叉尾鮰愛德華氏菌病滅活疫苗的制備方法主要包括鮰愛德華氏菌的分離純化、小體積活化培養、生物反應器的擴大培養、鮰愛德華氏菌的滅活、離心收集、提取畢赤酵母的基因組DNA、在滅活完全的菌體中加入一定量畢赤酵母基因組DNA混合等步驟。

申請人已將所述鮰愛德華氏菌菌種送到中國典型培養物保藏中心保藏，保藏日期為2010年7月30日，保藏中心保藏編號為CCTCC?NO：M2010191，分類命名為鮰愛德華氏菌CME001，Edwardsiella?ictaluri?CME001。

該方法利用分離到的高免疫原性強毒力鮰愛德華氏菌菌株，通過培養基和培養條件的優化培養提高主要保護性抗原的產量，以及采用的滅活方法可以減少滅活制備過程抗原的損失，加入畢赤酵母基因組DNA作為佐劑，組分的配伍設計科學合理，對目前養殖斑點叉尾鮰具有保護作用，有效地預防鮰愛德華氏菌引發的鮰愛德華氏菌病。

本發明的有益效果：

1.本發明的斑點叉尾鮰愛德華氏菌滅活疫苗使用安全，無藥物殘留，免疫防治效果顯著，能夠有效預防斑點叉尾鮰愛德華氏菌病的發生，免疫保護率可達80％。

2.加入佐劑設計科學合理，免疫效果好于單一鮰愛德華氏菌滅活疫苗。

3.使用可調連續注射器進行免疫接種方便，大大提高了免疫效率和接種疫苗劑量準確性。

4.本發明的疫苗其制備方法操作簡單，成本低廉，且疫苗可用于斑點叉尾鮰疾病的防治，具有很高的商業價值。

具體實施方式

1.將從病魚體內分離的鮰愛德華氏菌接種到胰蛋白胨大豆瓊脂培養基，28±0.5℃培養48小時。

2.將步驟(1)固體培養基上培養好的菌體，接種到已經高壓滅菌并盛有1000ml的胰蛋白胨大豆液體培養基的錐形瓶中，在振蕩搖床中進行小體積的液體活化培養，培養溫度28±0.5℃，搖床轉速120-150轉/分，培養時間為20-24小時。

3.按2％或3％的比例將步驟(2)中培養好的菌體接種到生物反應器中已經高壓滅菌的胰蛋白胨大豆液體培養基中，培養溫度28±0.5℃，培養時間24-48小時，當鮰愛德華氏菌生長到高峰，停止反應。

4.取出步驟(3)培養的菌液，加入0.2％福爾馬林溶液，滅活24-48小時。

5.離心后用磷酸鹽緩沖溶液將所得菌體稀釋成濃度為5.0×10⁷-5.0×10⁸CFU/ml。

6.將購買的畢赤酵母接種到YPD培養基，30±0.5℃培養24小時。

7.將步驟(6)固體培養基上培養好的菌體，接種到已經高壓滅菌并盛有100ml的YPD液體培養基的錐形瓶中，在振蕩搖床中進行液體活化培養，培養溫度30±0.5℃，搖床轉速120-150轉/分，培養時間為30小時。

8.按酵母基因組DNA提取試劑盒說明書提取畢赤酵母基因組DNA，用水將DNA稀釋到一定濃度。