[發(fā)明專利]一種仔豬副傷寒活疫苗的生產(chǎn)方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010254597.4
• 申請(qǐng)日: 2010-08-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101912608A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-12-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱良全;王棟;孫曄;劉延亭
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 北京海淀中海動(dòng)物保健科技公司
• 主分類(lèi)號(hào): A61K39/112
• 分類(lèi)號(hào): A61K39/112;A61K47/42;A61P31/04
• 代理公司: 北京君智知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 11305
• 代理人: 鄭明

技術(shù)背景

仔豬副傷寒(Paratyphus?swine)又稱豬沙門(mén)氏菌病(Swine?salmonellosis)，主要是由豬霍亂沙門(mén)氏菌(Salmonella?choleraesuis)引起的一種仔豬高熱傳染病，目前主要通過(guò)接種疫苗進(jìn)行預(yù)防。

仔豬副傷寒主要是由豬霍亂沙門(mén)氏菌引起幼豬和架子豬的敗血癥和腸炎，對(duì)成年豬多呈隱性帶菌或?yàn)樨i瘟的繼發(fā)感染菌，間或引起人類(lèi)的食物中毒以及侵害其他動(dòng)物。

我國(guó)應(yīng)用的仔豬副傷寒活疫苗CVCC500株(原C500株)(房曉文，李陽(yáng)隴，黃昌炳，鄭明，馮文達(dá)，孫偉等.仔豬副傷寒弱毒菌苗的研究，畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，1979)，對(duì)仔豬有堅(jiān)強(qiáng)免疫力，毒力穩(wěn)定、安全，在豬沙門(mén)氏菌病防控中發(fā)揮了重要作用。但仍存在以下突出問(wèn)題：1.疫苗采用普通肉湯作為培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基主要成分牛肉浸液的質(zhì)量受牛肉的種類(lèi)、年齡、新鮮及消化程度影響大，造成批次間不穩(wěn)定。2.疫苗采用1.5％明膠、5％蔗糖為保護(hù)劑，組方簡(jiǎn)單，凍干存活率低，保護(hù)功能較差(尤其在較高溫度下)。目前國(guó)內(nèi)14個(gè)生產(chǎn)仔豬副傷寒活疫苗的獸用生物制品企業(yè)，凍干存活率一般為50％～60％，需要-15℃以下保存。存活率低使疫苗中含有大量死亡菌體，死亡菌體崩解產(chǎn)生的內(nèi)毒素，是產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng)的因素之一，另外低溫保存給邊遠(yuǎn)地區(qū)儲(chǔ)運(yùn)和使用帶來(lái)困難。據(jù)報(bào)道，每年0.07％～0.1％的豬接種后出現(xiàn)嘔吐、痙攣、全身發(fā)疳、死亡等癥狀。

本發(fā)明的目的是研究一種合成培養(yǎng)基、耐熱保護(hù)劑及其相配套的凍干曲線，制備一種凍干菌存率高，能在2～8℃長(zhǎng)期保存的仔豬副傷寒活疫苗。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的技術(shù)方案是：將種子液按培養(yǎng)基總量的1％～2％接種于液體培養(yǎng)基中，37℃發(fā)酵或通氣培養(yǎng)18～21h，培養(yǎng)過(guò)程中根據(jù)需要加入適量消泡劑，并根據(jù)pH升高情況加入適量滅菌40％葡萄糖以控制pH值。培養(yǎng)結(jié)束后立即加入經(jīng)過(guò)滅菌并預(yù)熱至37℃的凍干保護(hù)劑，充分混勻后按規(guī)定頭份分裝。分裝過(guò)程中應(yīng)注意保溫振搖均勻，每頭份活菌數(shù)不少于3×10⁹CFU。

1生產(chǎn)菌株

(1)菌株來(lái)源

豬霍亂沙門(mén)氏菌CVCC79500株(即原C500株)，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保管和供應(yīng)。其原始菌種系豬霍亂沙門(mén)氏菌CVCC79101株(來(lái)自蘇聯(lián)獸藥監(jiān)察所，編號(hào)為133/8。特性：該菌種肉肝胃培養(yǎng)物50×10⁴CFU活菌致死小鼠，5000×10⁴CFU活菌致死海豬，1.5×10⁸CFU活菌靜脈注射致死仔豬。血清型：6，7:C:1，5。)經(jīng)0.05％～1％醋酸鉈的普通肉湯傳500代，每間隔50代逐步提高醋酸鉈濃度，人工致弱而來(lái)。

(2)菌株特性

1)毒力：用體重18～22g(30～35日齡)小白鼠皮下注射1×10⁸CFU活菌(0.2ml)，90％以上存活；豚鼠(350～400g)皮下注射15×10⁸CFU活菌，90％以上存活；家兔(體重1.5～2.0kg)皮下注射100×10⁸CFU活菌(1ml)，100％存活；仔豬(體重15kg以上)靜脈注射30×10⁸CFU活菌(1ml)，100％存活。

2)菌株穩(wěn)定性：在普通瓊脂上連傳20代，或在仔豬連通過(guò)3代，毒力不返強(qiáng)。

3)免疫原性：以25×10⁸CFU活菌免疫家兔(體重1.5kg)，一個(gè)月后攻擊2～4MLD(最小致死劑量)強(qiáng)毒菌，保護(hù)80％以上；以25×10⁸CFU活菌免疫仔豬(體重12kg)，靜脈注射致死劑量強(qiáng)毒，保護(hù)60％以上(中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程二○○○版.化學(xué)工藝出版社，2000，以下稱《規(guī)程》)。

2.疫苗制造及半成品檢驗(yàn)

(1)生產(chǎn)用種子制備

將豬霍亂沙門(mén)氏菌(CVCC79500株)凍干菌種用普通肉湯稀釋后，接種普通瓊脂平板，37℃培養(yǎng)18～20h，選取中等大小的典型菌落(菌落為圓形、邊緣整齊、突起、半透明、略濕潤(rùn)的光滑型)5～10個(gè)，混合接種于普通瓊脂斜面3～5支，37℃培養(yǎng)24h，經(jīng)純粹檢查合格后作為一級(jí)種子。在2～8℃保存，應(yīng)不超過(guò)2個(gè)月。取一級(jí)種子按2％接種普通肉湯，37℃培養(yǎng)24h，純粹檢查合格后，作為種子液。

(2)培養(yǎng)基