[發明專利]一種用合成培養基生產仔豬副傷寒活疫苗的方法

有效

• 申請號: 201010254578.1
• 申請日: 2010-08-17
• 公開（公告）號: CN101926987A
• 公開（公告）日: 2010-12-29
• 發明（設計）人: 朱良全;孫曄;王棟;劉延亭
• 申請（專利權）人: 北京海淀中海動物保健科技公司
• 主分類號: A61K39/112
• 分類號: A61K39/112;C12N1/20;A61P31/04;C12R1/42
• 代理公司: 北京君智知識產權代理事務所 11305
• 代理人: 鄭明

技術領域本發明涉及一種用合成培養基生產仔豬副傷寒活疫苗的方法，屬于生物學領域，特別是獸用生物制品領域。

背景技術

仔豬副傷寒(Paratyphus?swine)又稱豬沙門氏菌病(Swine?salmonellosis)，主要是由豬霍亂沙門氏菌(Salmonella?choleraesuis)引起的一種仔豬高熱傳染病，目前主要通過接種疫苗進行預防。

我國應用的仔豬副傷寒活疫苗是用豬霍亂沙門氏菌CVCC79500株(原C500株)弱毒菌株(房曉文，李陽隴，黃昌炳，鄭明，馮文達，孫偉.仔豬副傷寒弱毒菌苗的研究.畜牧獸醫學報，1981，12(2)：99-106)制備的，由中國獸醫藥品監察所鑒定、保管和供應，對仔豬有堅強免疫力，毒力穩定、安全。在豬沙門氏菌病防控中發揮了重要作用。

我國獸醫生物制品中，制苗用菌液生產采用的是傳統的天然培養基，如普通肉湯、馬丁湯、肉肝胃膜消化湯等，制作繁瑣。其主要成分肉浸液受動物的種類、年齡、及肉源的新鮮與消化程度影響大，造成疫苗的質量不穩定。大規模發酵用合成培養基按照細菌營養代謝特點設計，添加了促進菌體增殖、提高保護性抗原含量的生長因子，具有培養菌數高、質量穩定、操作簡便等優點。合成培養基是細菌凍干活疫苗質量好壞的關鍵因素，有鑒于此，本發明的目的在于設計一種適合豬霍亂沙門氏菌CVCC79500株生長、成分相對確定、易于在線檢測、監控和及時調整的合成培養基，制備仔豬副傷寒活疫苗。

發明內容

將豬霍亂沙門氏菌CVCC79500株種子液按培養基總量的1％～2％接種于以胰酪蛋白胨和酵母浸出粉為主要原材料的液體合成培養基中，37℃發酵或通氣培養18～21h，培養過程中根據需要加入適量消泡劑，并根據pH升高情況加入適量滅菌40％葡萄糖以控制pH值。培養結束后，立即加入經過滅菌處理并預熱至37℃的常用的凍干保護劑，充分混勻分裝后，真空冷凍干燥而成。每頭份活菌數不少于3×10⁹CFU。

本發明的詳細描述

1.疫苗生產用菌種

(1)來源豬霍亂沙門氏菌CVCC79500株菌種，由中國獸醫藥品監察所鑒定、保管和供應(房曉文、李陽隴)。其原始菌種系豬霍亂沙門氏菌CVCC79101株(來自蘇聯獸藥監察所，編號為133/8。特性：該菌種肉肝胃培養物50×10⁴CFU活菌致死小鼠，5000×10⁴CFU活菌致死海豬，1.5×10⁸CFU活菌靜脈注射致死仔豬。血清型：6，7：C：1，5。)經0.05％～1％醋酸鉈的普通肉湯傳500代，每間隔50代逐步提高醋酸鉈濃度，人工致弱而來。

(2)菌種特性

毒力：小鼠皮下注射1×10⁸CFU活菌，90％以上存活；豚鼠皮下注射15×10⁸CFU活菌，80％以上存活；家兔皮下注射100×10⁸CFU活菌，100％存活；仔豬靜脈注射30×10⁸CFU活菌，100％存活。菌株毒力穩定，在普通瓊脂上傳20代，仔豬3代，毒力不返強。

免疫原性：25×10⁸CFU活菌免疫家兔，攻擊2～4MLD強毒，保護80％以上；25×10⁸CFU活菌免疫仔豬，靜脈注射致死劑量強毒，保護60％以上。

2.培養基采用本發明設計的合成培養基

(1)配方(W/V)如下：

胰酪蛋白胨1％～2％、酵母浸出粉3％～4％、氯化鈉0.05％、磷酸二氫鉀0.0077％、磷酸氫二鈉0.0867％和葡萄糖0.05％。

(2)合成培養基配制方法

按上述配方依次稱取培養基成分加入到注射用水中，充分溶解后用2mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH值為7.2～7.4，116℃滅菌30min。臨用時，無菌操作加入終濃度1％的50％葡萄糖溶液，混勻。

50％葡萄糖溶液(W/V)稱取50g葡萄糖，加注射用水溶解，定容至100ml，116℃滅菌30min，2～8℃保存。

2mol/L的氫氧化鈉溶液稱取8g氫氧化鈉，加注射用水溶解，定容至100ml，116℃滅菌30min，2～8℃保存。

(3)合成培養基檢驗

1)性狀溶液澄清透明、呈棕色。

2)無菌檢驗按中華人民共和國獸藥典(中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典二○○五版三部.中國農業出版社，2006，以下稱《中國獸藥典》)規定的方法進行，應無菌生長。

3)pH值應為7.2±0.2。

4)生長試驗