[發(fā)明專利]含JERE盒的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及構(gòu)建和在基因工程上的應(yīng)用

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010254493.3
• 申請(qǐng)日: 2010-08-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101886080A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-11-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 何水林;黃定全;王小燕;王芳權(quán);方開(kāi)星;劉志欽;官德義;牟少亮
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 福建農(nóng)林大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/113
• 分類號(hào): C12N15/113;C12N15/10;A01H5/00
• 代理公司: 福州元?jiǎng)?chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊

技術(shù)領(lǐng)域???

本發(fā)明涉及一種誘導(dǎo)型啟動(dòng)子及構(gòu)建和在基因工程上的應(yīng)用，更具體地涉及了一種含JERE盒的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子在單子葉植物水稻抗病蟲(chóng)基因工程中的應(yīng)用，屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)???

真菌、細(xì)菌、病毒等病原微生物的侵染常造成各種農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量的下降。培育和推廣抗病品種是防治作物病害、保證作物穩(wěn)產(chǎn)高產(chǎn)最安全有效的途徑。利用植物自身抗病基因，通過(guò)常規(guī)育種和分子標(biāo)記輔助育種方法已培育了許多抗病新品種。然而，抗性基因在種屬間利用具有一定的局限性。轉(zhuǎn)基因方法可克服上述局限，為作物抗病育種開(kāi)辟了一條新途徑，也是植物種質(zhì)創(chuàng)新的重要途徑之一。目前，在轉(zhuǎn)基因技術(shù)中所使用的啟動(dòng)子大多數(shù)為組成型啟動(dòng)子，如果使用植物組織特異性啟動(dòng)子或病原誘導(dǎo)的植物啟動(dòng)子不僅會(huì)獲得目的產(chǎn)物、達(dá)到預(yù)定目標(biāo)，而且也不會(huì)產(chǎn)生副作用。

植物基因啟動(dòng)子是位于結(jié)構(gòu)基因5’端上游區(qū)、含有順式作用元件的DNA序列，決定著下游基因轉(zhuǎn)錄的特異性、方向和效率，是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的中心。高等植物啟動(dòng)子區(qū)域存在各種特征元件，包括轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)、TATA盒、起始因子和不同的順式作用元件等。其中，TATA框是依賴于RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄所必需的，決定著轉(zhuǎn)錄起始，并調(diào)控著上游激活蛋白的行為；起始因子的功能與TATA盒相似，可影響轉(zhuǎn)錄的方向和起始點(diǎn)的定位，但一般不能改變啟動(dòng)子內(nèi)包含2個(gè)核心序列因子的TATA活性。植物的許多性狀與啟動(dòng)子的結(jié)構(gòu)及其調(diào)控方式密切相關(guān)。因此，研究啟動(dòng)子不僅可以為基因工程提供重要的調(diào)控元件，也可促進(jìn)從遺傳分子基礎(chǔ)上發(fā)掘具有重要利用價(jià)值的植物新資源。

根據(jù)植物啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄模式可將其分為組成型啟動(dòng)子、組織特異型啟動(dòng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。

組成型啟動(dòng)子調(diào)控的基因表達(dá)不受時(shí)空限制和某種物質(zhì)的誘導(dǎo)而在植物中表達(dá)出來(lái)。雙子葉植物中常用的組成型啟動(dòng)子花椰菜花葉病毒(CaMV)35S啟動(dòng)子是目前植物基因工程中使用最多的啟動(dòng)子，它驅(qū)使轉(zhuǎn)基因產(chǎn)生組成型表達(dá)。它是異源病毒型啟動(dòng)子，在轉(zhuǎn)基因植物中具有較高的表達(dá)活性。組成型啟動(dòng)子可應(yīng)用于評(píng)價(jià)一個(gè)基因的生物學(xué)功能、轉(zhuǎn)基因表達(dá)數(shù)量及其活性，但在改良轉(zhuǎn)基因作物的實(shí)際應(yīng)用中的主要問(wèn)題是：(1)組成型啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的基因在植物各組織中均有不同程度表達(dá)，它驅(qū)動(dòng)外源基因在植物的各種組織和所有發(fā)育階段都會(huì)表達(dá)，產(chǎn)生大量異源蛋白或代謝產(chǎn)物在植物體內(nèi)積累，打破了植物原有的代謝平衡，增加了植株的代謝負(fù)擔(dān)，有些產(chǎn)物甚至對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有毒，造成了物質(zhì)和能量上的巨大浪費(fèi)，同時(shí)還會(huì)改變植物的形態(tài)，影響植物正常的生長(zhǎng)發(fā)育，甚至導(dǎo)致死亡；(2)植物所有細(xì)胞可能會(huì)全部進(jìn)入防御模式，即使在無(wú)病原侵染時(shí)仍進(jìn)行抗病反應(yīng)；(3)組成型啟動(dòng)子調(diào)控表達(dá)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物可在人和動(dòng)物食用的植物組織中積累，但是生物安全性要求不能有轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物。

如果用組織、器官特異型和病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子取代組成型啟動(dòng)子，使外源基因能夠定時(shí)、定點(diǎn)、定量地在植物中表達(dá)，可以克服組成型啟動(dòng)子帶來(lái)的問(wèn)題。因此，組織特異型啟動(dòng)子和病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的研究與應(yīng)用是植物基因工程的重要內(nèi)容和當(dāng)今國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。利用啟動(dòng)子的最好方法可能是利用一個(gè)內(nèi)源抗性基因啟動(dòng)子，這樣既可以減少植物的代謝負(fù)擔(dān)，又可以避免植物防御反應(yīng)的假性激活。

比組成型表達(dá)和組織特異型表達(dá)更理想的表達(dá)模式是，只在需要的時(shí)間和地點(diǎn)表達(dá)而且僅在感染部位啟動(dòng)抗病相關(guān)基因表達(dá)。病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子能達(dá)到上述較為理想的結(jié)果，防止“逃離細(xì)胞死亡”現(xiàn)象出現(xiàn)，消除了對(duì)植物生長(zhǎng)和發(fā)育影響的副作用。一種理想的病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子應(yīng)迅速被廣譜野生型病原侵染所激活，并有廣譜抗病性。然而由于植物對(duì)不同病原菌采取了不同的防御機(jī)制，許多重要植物抗病分子機(jī)制尚不明確，所以，目前分離的大多數(shù)病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子很少能滿足上述要求，仍然存在輕微的“逃離細(xì)胞死亡”的現(xiàn)象。因此，迫切需要分離或人工構(gòu)建理想的病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。植物抗病機(jī)制研究、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和啟動(dòng)子克隆技術(shù)的發(fā)展，為人工構(gòu)建新的病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子奠定了基礎(chǔ)。

當(dāng)前可使用的病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子缺乏的主要原因是分離各種天然的病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子較少。與天然病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子相比，人工構(gòu)建病原誘導(dǎo)型啟動(dòng)子不僅更具有廣譜性，而且可根據(jù)不同目的進(jìn)行靈活選擇，如消除啟動(dòng)子表達(dá)元件，可改變啟動(dòng)子的強(qiáng)度和病原誘導(dǎo)表達(dá)基因的數(shù)量和質(zhì)量。研究發(fā)現(xiàn)，啟動(dòng)子元件在不同植物品種中防御信號(hào)是相對(duì)保守的。因此，通過(guò)收集各種植物啟動(dòng)子元件可以人工構(gòu)建病原啟動(dòng)子。