[發明專利]一種制備基因傳輸載體碳酸鈣納米的方法

無效

• 申請號: 201010252878.6
• 申請日: 2010-08-13
• 公開（公告）號: CN102070171A
• 公開（公告）日: 2011-05-25
• 發明（設計）人: 劉霆;張鴿文;陶一明;賀孝文;劉輝;張桂英
• 申請（專利權）人: 劉霆;張鴿文;陶一明
• 主分類號: C01F11/18
• 分類號: C01F11/18;B82B3/00;C12N15/63
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

所屬技術領域：

該方法制備的納米是一種無毒、生物相容性好、可生物降解，并能夠用作基因傳輸載體，適用于生物制藥及腫瘤基因治療領域。?

背景技術：

載體問題一直是基因治療中亟待解決的關鍵問題之一，理想的轉染載體應具有安全性、高效性及穩定性：①安全性一方面是指載體本身不具備免疫原性，對機體無毒，另一方面指載體不會隨機與宿主的染色體整合，誘發突變等；②高效性是指可將目的基因靶向輸送到腫瘤組織且能感染大量的細胞；③穩定性是指載體可介導目的基因整合至宿主染色體的特異位點或能以附加體形式穩定存在，目的基因可長期表達而不需反復轉染。?

目前基因治療的臨床試驗多是利用病毒載體，雖然轉染率高，但存在其自身的缺陷，如最初使用的逆轉錄病毒載體，不能裝載大片段DNA，且可隨機整合至宿主的染色體，利用逆轉錄病毒為載體介導的基因治療曾導致多起白血病的發生；現在臨床試驗中常用的腺病毒，雖然不會隨機整合到宿主基因組中，不具備致瘤性，但是其編碼蛋白可激活機體免疫反應，且由于不整合到染色體組，隨著細胞的分裂而丟失，不能長期穩定表達。此外尚有腺相關病毒載體、慢病毒載體等，都有一定的局限性。?

目前有關非病毒載體的研究越來越廣泛，非病毒性載體雖然轉染效率不如病毒載體高，但是安全、制備簡單，且攜帶外源基因的容量較大。非病毒載體包括脂質體、陽離子多聚物及納米顆粒等。脂質體性質穩定，無插入突變的危險，它在將核酸導入細胞后即被降解，因而無毒性，無免疫原性，可在體內多次重復使用而不引起機體的免疫反應，而且制備容易、成本較低；但其缺點是體內轉染效率低，臨床應用受到一定限制，鑒于現有病毒載體和非病毒載體存在的缺陷，研制新型的非病毒載體已經成為了研究的熱點，納米顆粒因為具有小尺寸效應，表面效應，隨著顆粒直徑變小，比表面積將會顯著增大，故具有很高的化學活性，因而納米成為了最有應用前景的非病毒載體。研究表明，納米顆粒在體內的循環時間明顯長于普通大小的顆粒，在短時間內，不會很快被吞噬細胞清除，從而更多的滲出到血管外，組織間隙，延長與細胞的接觸時間，提高轉染效率；通常質粒DNA進入血管后很快被核酸酶消化降解，但納米基因載體有濃縮，保護DNA功能，與DNA形成一致密的結構，使DNA不被核酸酶消化降解。?

目前，采用的納米生物材料大致分為有機材料和無機材料兩大類，前者有多聚糖、高分子聚合物等，后者主要集中在對石英、羥基磷灰石、磁鐵粉、陶瓷、碳粒、硅氧化物及各種金屬或合金的研究。高分子聚合材料作為納米載體的研究越來越受到重視，其在基因的輸送中有許多的優越性，如能保護核苷酸的降解、有助于核苷酸轉染細胞，并可起到定位作用，能靶向輸送核苷酸，且可控制DNA的釋放速率，延長其在體內的作用時間等。生物降解性是藥物載體或基因載體的重要特征之一，通過降解，載體與藥物/基因片段定向進入靶細胞之后，表層的載體被生物降解，芯部的藥物釋放出來發揮療效，避免了藥物在其他組織中釋放。?

發明內容

本項目利用化學方法制備一種50nm左右大小、分散均勻的碳酸鈣納米顆粒，碳酸鈣納米顆粒能與質粒DNA有效結合，通過復合體吸附在細胞膜上并進入細胞內，增加進入細胞內DNA量，提高基因轉染的效?率，并且質粒DNA與納米顆粒形成的復合體能有效的抵抗血清中酶類對DNA分子的降解，有效的保護DNA分子的完整性。?

本新型納米所采用的技術方案?

本技術采用在表面活性劑作用下，(氯化鈣與碳酸鈉)的濃度比例為2∶1，溫度控制在30℃，攪拌速度為350rpm，化學合成制備的碳酸鈣納米顆粒大小在50nm左右，分散較好，本方法制備的過程中工藝要求較高；在改變各反應物的濃度、反應過程中的溫度會改變生成顆粒的大小及均勻度，以及反應合成時間、攪拌的速度的改變也同樣影響制備碳酸鈣納米的特性，我們經過反復的制備和檢測后，已基本形成較完善的制備工藝。?

本新型載體的有益效果?

作為基因轉染的載體必須要求載體能與DNA結合，并且能帶上完整的DNA進入細胞內，使外源基因得到有效的表達。碳酸鈣納米顆粒與帶負電荷的DNA結合；在中性的環境下，DNA能與碳酸鈣顆粒形成復合體，并且DNA與顆粒的結合形成復合體后能保護DNA不被血清降解，這對于體外細胞的培養及體內多酶環境具有重要的意義；作為基因轉染的載體要求對細胞、機體無毒。人體骨骼的主要組成成份為鈣、磷，碳酸鈣是可降解的無機材料，在體內可降解為鈣與磷，被骨質吸收，對機體基本無毒。應此該碳酸鈣納米可能作為基因轉染的有效載體之一，在腫瘤的基因治療中有著重要的意義，為臨床基因治療提供新的思路。?

具體實施方式