[發明專利]一種蛇足石杉組織培養的方法

有效

• 申請號: 201010252709.2
• 申請日: 2010-08-06
• 公開（公告）號: CN101889551A
• 公開（公告）日: 2010-11-24
• 發明（設計）人: 羅建平;楊雪飛;梁昊
• 申請（專利權）人: 合肥工業大學
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 合肥金安專利事務所 34114
• 代理人: 金惠貞

技術領域

本發明屬于植物組織培養技術領域，具體涉及到一種蛇足石杉組織培養體系建立的方法。

背景技術

蛇足石杉[Huperzia?serrata(Thunb.)Trev.]又名救命王、金不換、千層塔、山芝、蛇足草，屬蕨類石杉科(Huperiaceae)石杉屬(Huperzia?Bemh.)，是一種珍貴的藥用蕨類植物。民間常用其全草治療跌打損傷、淤血腫毒、精神分裂等疾病。其所含的石杉堿甲A(Huperzine?A)已被藥理實驗證明可低毒、高效、可逆且高選擇性地抑制乙酰膽堿酯酶(AchE)，已開發出多種成藥，可用于治療重癥肌無力、提高學習效率以及改善老年人的記憶功能等，為目前治療老年癡呆等疾病的特效藥，市場前景廣闊。由于人工合成的石杉堿甲A類似物副作用大且成本高，因此目前用于成藥的石杉堿甲A都來自野生資源。石杉堿甲的野生資源主要來源于石杉科石杉屬植物蛇足石杉、石杉科馬尾杉屬及石杉屬其他植物。目前絕大部分用于成藥的石杉堿甲A均提取自野生蛇足石杉。

由于蛇足石杉多生長在人跡罕至的山地密林或溝谷陰濕土中，對生境要求苛刻，生長緩慢，生產周期長；加之石杉堿甲在全草中含量甚微，目前，藥品生產完全依賴野生資源，價格昂貴，長期采挖造成資源急劇減少，其野生資源總量十分有限。因此，尋求石杉堿甲再生資源勢在必行。目前的研究顯示：通過芽孢、扦插、壓條和分株等營養繁殖方式進行蛇足石杉的人工栽培雖然可行，但繁殖系數和生物量較低，進行大規模人工栽培的條件還不成熟。而組織培養具有需要材料少、條件可控、不受季節限制、周期短、重復性強等優點，是石松植物快速繁殖和大規模工廠化生產的理想手段。通過組織培養技術對蛇足石杉進行擴大繁殖，旨在尋找一條方便快捷的繁殖途徑，以便為人工大量栽培提供技術支持，為滿足市場需求打下基礎。應用組織培養技術對蛇足石杉進行繁殖，既可擴大藥材來源，又能保護野生資源。

蛇足石杉組織培養過程中存在外植體滅菌困難、無菌外植體的獲得率低，外植體接種后污染和褐化現象嚴重，不能正常生長、分化和增殖，愈傷組織的誘導率極低且增殖困難等問題。雖然國內外研究者也進行了一些相關方面的嘗試，但是至今還沒有蛇足石杉組織培養成功的報道。

發明內容

針對蛇足石杉組織培養過程中存在外植體滅菌困難、無菌外植體的獲得率低，外植體接種后污染和褐化現象嚴重，不能正常生長、分化和增殖等問題，本發明通過對滅菌方法、培養基和培養條件的研究，實現了蛇足石杉組織培養較低的污染率、低褐化率、高成活率、高生長率、高分化率和高生根率；本發明旨在提供一種蛇足石杉組織培養的方法。

本發明的具體操作步驟如下：

一種蛇足石杉組織培養的方法包括以下步驟：

(1)選擇外植體

從野外采集蛇足石杉[Huperzia?serrata(Thunb.)Trev.]的孢子體，切取莖尖，經自來水沖洗干凈；

(2)殺滅表面菌

將洗凈的莖尖在超凈臺中先浸入濃度70％的乙醇溶液30-50s；接著置于濃度0.1％的升汞(HgCl₂)溶液浸泡7-10min，再轉入濃度7％的雙氧水(H₂O₂)溶液中浸泡10-15min，最后用無菌水沖洗3-5次，作為蛇足石杉組織培養的外植體；

(3)接種培養

將所述外植體接種在促進莖尖生長的改良MS培養基上，置于22-27℃、光照時間12-14h/d、光照強度800-2000lx條件下進行培養2-3周；

(4)殺滅內生菌

將接種培養后的外植體轉至含孔雀石綠和抗生素AAS的改良MS培養基上，繼續培養2-3周，培養條件同步驟(3)；對內生菌進行殺滅。

(5)擴繁培養

將步驟(4)經內生菌殺滅后無菌的外植體轉入叢生芽分化擴繁的改良MS培養基繼續培養一段時間，當莖尖頂芽長到5-8mm后，切取新長出的外植體頂芽約3-5mm轉接到叢生芽分化擴繁的改良MS培養基中進行組培苗的分化和增殖培養，培養條件同步驟(3)，從組培苗莖基部分化產生出叢生苗；

(6)生根培養

切取步驟(5)中從組培苗莖基部分化產生的叢生苗轉至生根培養基中，置于培養室進行生根培養，培養條件同步驟(3)；