[發(fā)明專利]一種編碼苦瓜多肽P的核酸序列

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010252525.6
• 申請(qǐng)日: 2010-08-13
• 公開（公告）號(hào): CN102373218A
• 公開（公告）日: 2012-03-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王富軍;趙健;王碧蓮;張文姬;張濤鑄;傅龍?jiān)?/a>
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 浙江日升昌藥業(yè)有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/29
• 分類號(hào): C12N15/29;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;C12N15/11;C12N15/10;C12N15/113;C07K14/415;C12Q1/68;A61K48/00;A61P3/10
• 代理公司: 上海天翔知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31224
• 代理人: 王裕

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種編碼苦瓜肽P的核酸序列及含其的重組載體和轉(zhuǎn)化體。

背景技術(shù)

苦瓜為葫蘆科苦瓜屬植物，性味苦寒，具有清暑滌熱，滋養(yǎng)強(qiáng)壯，降血糖等功效。關(guān)于苦瓜的性味、歸經(jīng)、功效，《滇南本草》稱“苦、寒、平，入心、脾、胃三經(jīng)……瀉六經(jīng)實(shí)火，清暑、益氣、止渴”。《本草綱目》苦瓜條謂“苦寒、無毒、除邪熱、解勞乏，清心明目”。清代張璐在《本經(jīng)逢原》中也稱苦瓜“為除熱解煩，清心明目之品”。《福建中草藥》載有以鮮苦瓜切碎水煎治療煩熱口渴的驗(yàn)方。中醫(yī)無糖尿病之病名，而從其臨床特征、癥狀表現(xiàn)上看屬中醫(yī)“消渴病”范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為：消渴病初起，多以燥熱為主，病程遷延，則陰虛與燥熱互見，病久則以陰虛為主。苦瓜“青則滌熱、明目清心。熟則養(yǎng)血滋肝，潤(rùn)脾補(bǔ)腎”(《隨息居飲食譜》)與所治消渴病之病機(jī)相一致[1]。

苦瓜降糖作用已為實(shí)驗(yàn)和臨床所證實(shí)，其降糖活性成分的研究也日趨深入。早在1960年，研究表明正常的及四氧嘧啶型糖尿病家兔灌服苦瓜漿汁后，其血糖水平明顯降低。此后各國藥學(xué)工作者開始致力于尋找苦瓜中的降糖活性成分。自1965年Sucrow從苦瓜果實(shí)中提取分離出苦瓜甙后，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)和證實(shí)了苦瓜甙是苦瓜降血糖的有效物質(zhì)。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)苦瓜的降糖成分可能還包括生物堿和類胰島素兩種類型的物質(zhì)。目前已知的苦瓜多肽有三種，分別為多肽-P，多肽-K和MC6。

1979年，Khanna等首先從苦瓜果實(shí)中發(fā)現(xiàn)一種水溶性類胰島素物質(zhì)，稱為多肽-P。多肽-P只有一條肽鏈，由166個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，含17種氨基酸，分子量11000，肌肉注射顯示降血糖作用，但口服無活性。1993年，我國學(xué)者王敬文等也報(bào)道從苦瓜果實(shí)中分出降血糖蛋白PA，分子量約38000[15]。

Khanna還從苦瓜種子中分離出一種稱為多肽-k的降糖活性物。多肽-k有兩條肽鏈，含18種氨基酸，分子量18000，不溶于水。605例病程2～20年的2型糖尿病患者舌下口服多肽-k(12mg/次，4次/d)，降糖效果十分明顯。

MC6則是從鮮苦瓜汁提取的水溶性多肽，包括MC6.1、MC6.2和MC6.3三種單鏈多肽，長(zhǎng)度分別為18、11和7個(gè)氨基酸，MC6.1、MC6.2多肽C端7個(gè)氨基酸序列與MC6.3多肽完全相同。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，這三種多肽不僅經(jīng)靜脈注射給藥有突出的降血糖效果，而且它們還表現(xiàn)有明顯的口服降血糖活性。

其中，苦瓜多肽P的氨基酸序列已知，本領(lǐng)域技術(shù)人員通過氨基酸序列可推斷出苦瓜多肽P可能的核酸序列，但卻一直未能獲得天然苦瓜多肽P的核苷酸序列，這可能與基因表達(dá)的特殊性有關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于解決苦瓜多肽P核酸序列未知的問題，而導(dǎo)致不能對(duì)苦瓜多肽P的生物學(xué)功能進(jìn)行深入研究并由此進(jìn)行應(yīng)用開發(fā)的困境。

為此，本發(fā)明公開了一種編碼苦瓜多肽P的核酸序列，其特征在于所述核酸序列編碼了如SEQ?ID?NO.1所示的被稱為苦瓜多肽P的氨基酸序列。

在一些實(shí)施例中，所述核酸序列為如SEQ?ID?NO.2所示或至少與SEQ?ID?NO.2所示的核酸序列90％同源性且具有降糖活性的核酸序列。

另一方面，本發(fā)明公開了一種重組載體，其特征在于其含有編碼如SEQ?ID?NO.1所示氨基酸序列的核酸序列。

在一些實(shí)施例中，所述核酸序列為如SEQ?ID?NO.2所示或至少與SEQ?ID?NO.2所示的核酸序列90％同源性且具有降糖活性的核酸序列。

另一方面，本發(fā)明還公開了一種轉(zhuǎn)化體，其特征在于其包括表達(dá)氨基酸序列如SEQ?IDNO.1所示的重組載體。

另一方面，本發(fā)明公開了上述編碼苦瓜肽P的核酸序列的制備方法，包括下列步驟：

苦瓜種子全RNA的抽提；

RT-PCR及兼并PCR；

回收PCR產(chǎn)物并連接到T載體，轉(zhuǎn)化，搖菌，測(cè)序；

染色體步移；

回收PCR產(chǎn)物并連接到T載體，轉(zhuǎn)化，搖菌，測(cè)序。

另一方面，本發(fā)明還公開了一種8-100個(gè)核苷酸的探針，其特征在于所述探針的序列可識(shí)別如SEQ?ID?NO.2所示核酸序列。

另一方面，本發(fā)明還公開了所述探針在生物檢測(cè)或基因克隆中的應(yīng)用。

另一方面，本發(fā)明還公開了另一方面，本發(fā)明還公開了一種反義核酸藥物，其特征在于所述反義核酸藥物包含反義核酸和藥學(xué)上可接受的載體，所述反義核酸與如SEQ?IDNO.2所示核酸序列配對(duì)。