[發(fā)明專利]一種利用牙簽刺傷法接種番茄黃化曲葉病毒的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010251233.0
• 申請日: 2010-08-12
• 公開（公告）號: CN101948810A
• 公開（公告）日: 2011-01-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 季英華;周益軍;周曉偉;程兆榜;周彤
• 申請（專利權(quán)）人: 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種番茄黃化曲葉病毒的接種方法，屬植物保護(hù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

番茄黃化曲葉病是番茄上一種毀滅性的病毒病，該病自1964年首次報道以來，在歐洲、非洲、亞洲、加勒比海及大洋州等地區(qū)都有發(fā)生危害的報道，特別是近年來，隨著全球氣候變暖和耕作制度的改變以及國際間貿(mào)易的增加，番茄黃化曲葉病在全球范圍傳播，給番茄生產(chǎn)造成了嚴(yán)重?fù)p失。1991-1992年該病在美國佛羅里達(dá)州番茄上暴發(fā)，造成的損失達(dá)1.4億美元。

在我國，由番茄黃化曲葉病毒(Tomato?yellow?leaf?curl?virus，TYLCV)導(dǎo)致的番茄黃化曲葉病最早于2006年在上海和浙江出現(xiàn)危害報道，番茄受其侵染后早期會表現(xiàn)葉緣黃化、上卷，葉片變小、植株矮縮；后期整株上部呈現(xiàn)簇縮狀，花萎蔫，座果率大大降低，嚴(yán)重影響番茄的產(chǎn)量和質(zhì)量，發(fā)病重的棚室多造成絕產(chǎn)絕收，經(jīng)濟(jì)損失巨大。2007年該病傳入江蘇、安徽、山東危害，隨后在河北、北京、天津、內(nèi)蒙古等省市也相繼出現(xiàn)危害，擴(kuò)展蔓延速度十分驚人，同時造成的危害也異常慘重。2008年末到2009年初僅河北邯鄲市因番茄黃化曲葉病造成的直接經(jīng)濟(jì)損失就近1億元。目前該病已經(jīng)逐漸成為當(dāng)前我國番茄生產(chǎn)上一個重要的制約因素。

由于番茄黃化曲葉病毒是一種煙粉虱傳播的病毒，因此常規(guī)的生物學(xué)實驗常常采用煙粉虱接種法來研究番茄黃化曲葉病毒。但是由于該方法操作過程中需要煙粉虱來實現(xiàn)傳毒，因此無論是在室內(nèi)還是在田間實驗，該方法都存在一些難于克服的問題：1、煙粉虱的接種蟲量難于控制，由于煙粉虱的生活周期非常短，世代重疊現(xiàn)象非常嚴(yán)重，導(dǎo)致其群體增殖能力非常強(qiáng)，而煙粉虱的個體又非常小，因此無論是在田間還是在室內(nèi)，單株上接種的煙粉虱數(shù)量很難控制；2、帶毒煙粉虱的接種數(shù)量難于控制，由于煙粉虱本身的接種蟲量難于控制，也導(dǎo)致了其中帶毒煙粉虱的接種蟲量難于計量；3、煙粉虱的傳毒效率難于控制，由于煙粉虱是一種傳毒昆蟲，只有在其取食的過程中才能實現(xiàn)傳毒，而其取食受諸多因素影響，如溫度、濕度、光照、寄主等等，這些因素會影響其取食次數(shù)及取食量，對接種效率產(chǎn)生影響，進(jìn)而對實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性也產(chǎn)生影響；4、由于煙粉虱傳播的病毒非常多，因此使用煙粉虱接種番茄黃化曲葉病毒的時候，煙粉虱可能同時攜帶其它病毒，影響接種結(jié)果。

除了煙粉虱接種方法外，還有一些其它的接種方法，如農(nóng)桿菌注射接種法、嫁接接種法、基因槍轟擊接種法(biolistic?inoculation)，但是這些接種方法也存在操作繁瑣、成本較高、難于適用于大量樣本操作等問題。

為了解決煙粉虱等接種方法上存在的問題，我們創(chuàng)制了一種牙簽刺傷接種的方法，該方法操作簡便、重復(fù)性好、可控性好、效率高、成本低、結(jié)果準(zhǔn)確，為研究番茄黃化黃化曲葉病毒提供了一種新方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的缺點，為番茄黃化曲葉病毒的接種提供了一種簡便、經(jīng)濟(jì)、有效的方法。

1、接種用的材料：

含PTYj01的農(nóng)桿菌保存于江蘇省農(nóng)科院植保所病害室(江蘇省南京市孝陵衛(wèi)鐘靈街50號，210014)，YEP培養(yǎng)基及抗生素的配制參照《分子克隆實驗指南(第三版)》。

2、接種處理方法

a)將含有PTYj01的農(nóng)桿菌接種含50mg/ml的卡那霉素(Kanamycin，Km)和50mg/ml的利福平(Rifamycin)的YEP液體培養(yǎng)基中，28℃150rpm培養(yǎng)至OD₆₀₀達(dá)到0.6-0.8。

b)在溫室內(nèi)(溫度為25-28℃)用穴盤育苗，2片真葉時移至一次性營養(yǎng)缽中，3-4片葉時進(jìn)行接種處理。

c)用牙簽尖頭蘸取菌液于3-4葉期番茄莖桿韌皮部刺傷3-4處(每刺傷1處蘸取菌液1次)，處理后的番茄于溫室(溫度為25-28℃)內(nèi)放置，觀察發(fā)病情況。

本發(fā)明的有益效果是避免了常規(guī)煙粉虱接種方法的上的缺陷，無需飼養(yǎng)煙粉虱，無需繁瑣的操作，只要通過簡單的牙簽刺傷莖桿就可以實現(xiàn)番茄黃化曲葉病毒的接種。

附圖說明

附圖是牙簽刺傷法接種番茄黃化曲葉病毒示意圖

具體實施方式

實例一：

以合作903大紅番茄為材料，通過牙簽刺傷法接種番茄黃化曲葉病毒。

1、實驗處理

a)將含有PTYj01的農(nóng)桿菌接種含50mg/ml的卡那霉素(Kanamycin，Km)和50mg/ml的利福平(Rifamycin)的YEP液體培養(yǎng)基中，28℃150rpm培養(yǎng)至OD₆₀₀達(dá)到0.6-0.8。