[發明專利]一種同時檢測精子脫氧核糖核酸碎片及膜完整性的方法

無效

• 申請號: 201010249741.5
• 申請日: 2010-08-10
• 公開（公告）號: CN101907620A
• 公開（公告）日: 2010-12-08
• 發明（設計）人: 王磊光;邱毅;張麗紅
• 申請（專利權）人: 山東省計劃生育科學技術研究所
• 主分類號: G01N33/48
• 分類號: G01N33/48;G01N1/30;G02B21/34;C12Q1/68
• 代理公司: 山東濟南齊魯科技專利事務所有限公司 37108
• 代理人: 陳月華

技術領域

本發明涉及醫學臨床上使用的檢測方法，確切地說是一種同時檢測精子脫氧核糖核酸碎片及膜完整性的方法。

背景技術

精子膜完整性與精子代謝、頂體反應、精子獲能及精卵融合密切相關，測定精子膜是否完整可以準確地反映精子功能并預測精子潛在受精能力。自1984年建立精子尾部低滲腫脹實驗測定人精子膜功能以來，精子尾部低滲腫脹實驗已成為目前不多的幾個評價精子膜功能的檢測方法之一，越來越廣泛地運用于男性生殖避孕的基礎研究和不育的臨床診治中。細胞的物質交換和新陳代謝活動依靠細胞膜進行，精子在男、女性生殖道中極易受到各種化學物質影響，精子膜對這些物質的傳遞能力直接影響精子的活力和新陳代謝，從而關系到能否獲能，完成受精的全過程。因此，評價精子膜功能在精子功能檢測中具有重要意義。但是，單純的精子低滲腫脹實驗只能確定一個精子膜是否完整，而不能鑒別其DNA是否完整，而僅單純檢測精子膜的完整性，而不檢測精子脫氧核糖核酸碎片的完整性還不能準確地判斷精子的活性，因此，現有的實驗方法難以準確判斷出同一條精子的膜及DNA是否有損傷，即難以對精子的質量作出精確的評價。

發明內容

本發明的目的，是提供了一種同時檢測精子脫氧核糖核酸碎片及膜完整性的方法，它可解決現上述技術存在的問題，它是將精子低滲腫脹實驗與精子染色質擴散實驗兩個實驗有機地結合在一起，其優點是可以同時顯示同一條精子其膜是否完整及染色質是否完整，可輔助人們精確判斷精子的質量。

本發明的目的是通過以下技術方案實現的：一種同時檢測精子脫氧核糖核酸碎片及膜完整性的方法，其步聚如下：

①制備低滲液

低滲液為每100ml蒸餾水中含0.735g檸檬酸鈉和1.35g果糖，滲透壓是150mOsm的溶液；

②制備伊紅-吉姆薩染液

向每100ml的0.9%的生理鹽水中加入0.5g伊紅和0.1g吉姆薩，混勻，使其充分溶解，配成染液，再用雙層濾紙過濾，所得濾液即伊紅-吉姆薩染液，伊紅-吉姆薩染液置于22℃室溫內保存備用；

③單純精子低滲腫脹實驗：

向每1ml步驟①中所述的低滲液中加入0.1ml精液，混勻，在水溫為37℃的水中水浴30分鐘后，得低滲處理后精液，觀察200個精子，計算尾部腫脹的精子比率；

④取1ml步驟③中所述的低滲處理后精液，用離心機以1000轉/分的轉速離心處理5?分鐘，靜置分層后，棄上清液，所得精液用精子沉渣用磷酸鹽緩沖液稀釋到10×10⁶/ml；

⑤取0.2ml步驟④中所述的稀釋精液與瓊脂凝膠按體積比1：1比例混勻后，放置在離心管內，在室溫37℃條件下孵育5分鐘得配制精液；

⑥吸取50--l步驟⑤中所述的配制精液置入載玻片上，加蓋蓋玻片，在環境溫度4℃的條件下放置4分鐘；所述載玻片是表面設有干燥的瓊脂層的載玻片；

⑦將步驟⑥中所述的載玻片去除蓋玻片，在室溫22℃條件下放入摩爾濃度為0.081mol/L的HCl溶液內浸泡7分鐘；

⑧在22℃室溫下向步驟⑦所述的載玻片上加入50--l?的0.4mol/L的三羥甲基氨基甲烷，50--l的?0.8mol/L的二硫蘇糖醇和50--l的1%（重量）的磺化琥珀酸N－月桂基單酰胺二鈉鹽，上述三種溶液混合將載玻片浸泡5分鐘，浸泡5分鐘后的載玻片制成標本片；

⑨將步驟⑧中所述的標本片用緩沖液沖洗2分鐘，所述緩沖液中各物質含量為：三羥甲基氨基甲烷0.09mol/L和乙二胺四乙酸0.002mol/L；

⑩將所述標本片分別放入70%、90%和100%的乙醇中各脫水2分鐘；

經步驟⑩脫水后的標本片在空氣中自然干燥后加入染液染色，在顯微鏡下觀察結果。

為進一步實現本發明的目的，還可以采用以下技術方案實現：步驟①中所述的蒸餾水是雙蒸水。步驟中所述的染液是4',6-二脒基-2-苯基吲哚，加入染色后在日本產型號Nikon-E1000的熒光顯微鏡下觀察結果。步驟中所述的染液是瑞-吉氏染液，加入染色后在自然光顯微鏡下觀察精子。步驟⑥中所述的載玻片按以下方法制作：先用瓊脂澆制于載玻片表面，再在80℃的環境下將其表面的瓊脂干燥。步驟①中所述的低滲液的離子強度為0.15。步驟⑤中所述的離心管是1.5ml的離心管。