[發明專利]一種葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶及其表達

無效

• 申請號: 201010248207.2
• 申請日: 2010-08-02
• 公開（公告）號: CN101955922A
• 公開（公告）日: 2011-01-26
• 發明（設計）人: 肖亞中;房偉;方澤民;張學成;彭惠;洪宇植
• 申請（專利權）人: 安徽大學
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12N15/56;C12N15/63;C12N15/66;C12N15/70;C12N1/21;C12R1/19
• 代理公司: 安徽省合肥新安專利代理有限責任公司 34101
• 代理人: 何梅生

1.一種葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶，其特征在于，其基因編碼具有如下核苷酸序列之一：

(1)序列表中SEQ?ID?No：1；

(2)序列表中的SEQ?ID?No：1經取代、缺失或添加一個或幾個核苷酸且編碼相同功能蛋白質的核苷酸序列；

(3)編碼序列表中SEQ?ID?No：2蛋白質序列的多核苷酸序列。

2.含有權利要求1所述基因編碼的葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶，其特征在于，具有下列氨基酸序列之一：

(1)序列表中的SEQ?ID?No：2；

(2)序列表中的SEQ?ID?No：2經取代、缺失或添加一個或幾個氨基殘基且編碼相同功能蛋白質的氨基酸序列。

3.含有權利要求1所述的細菌漆酶基因的重組表達載體。

4.含有權利要求1所述葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶基因的宿主菌。

5.含有權利要求1所述葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶基因的重組表達載體的構建方法，其特征在于，具體包括如下步驟：

(1)以包含葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶基因的BAC(細菌人工染色體載體(Bacterial?Artificial?Chromosome，)載體DNA為模板，以P1和P2為引物進行PCR擴增，得到PCR擴增產物；所述引物為：

P1：5′-GCCTCCCATATGACTAAAATATCTTTACCAAC-3′

P2：5′-CCGAAACTCGAGTCTATTTGAGATTAATGCTT-3′

(2)將步驟(1)所得PCR擴增產物和pMD18-T質粒連接，得連接產物；將連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，篩選陽性克隆，進行序列分析；挑選序列正確的克隆提取質粒，獲得含有葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶基因(bgl1A)的pMD18-T重組質粒；

(3)用Nde?I和Xho?I雙酶切步驟(2)所得的pMD18-T重組質粒和pET22質粒，然后用T4連接酶將酶切后的bgl1A與pET22b(+)質粒連接，得到連接產物；連接產物轉化大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，篩選陽性克隆，得到含有本發明bgl1A基因的工程菌株E.coli?BL21(DE3)/pET22b(+)-bgl1A。

6.葡萄糖耐受的β-葡萄糖苷酶的制備方法，其特征在于：

將根據權利1所述的核酸分子或根據權利3或5所述的載體轉移到微生物宿主細胞中用于表達核酸分子，或利用根據權利4所述的表達宿主表達核酸分子；以及任選的從宿主細胞中分泌所表達的多肽。

E.coli?BL21(DE3)/pET22b(+)-bgl1A接種于含有氨芐青霉素的200ml?LB液體培養基中，放置于37℃、250rpm條件下培養至OD₆₀₀＝0.6；加入終濃度為0.75mM的IPTG進行誘導，并于30℃、180rpm條件下繼續培養5小時；4℃、8000g離心收集菌體，加入0.1倍菌液體積的Binding?buffer，350W冰浴條件下超聲40min破碎細胞，30000g離心收集上清，得到粗酶液，所述粗酶液經過Ni-NTA柱層析進行純化，得到高純蛋白。