[發(fā)明專利]一種玉米心葉特異性啟動子及其應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010247328.5
• 申請日: 2010-08-06
• 公開（公告）號: CN102373201A
• 公開（公告）日: 2012-03-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 洪龍;魏桐;徐唯濤;高遠(yuǎn);顧紅雅;瞿禮嘉
• 申請（專利權(quán)）人: 北京大學(xué)
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;A01H5/00
• 代理公司: 北京君尚知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11200
• 代理人: 李稚婷

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及植物啟動子的克隆及其應(yīng)用，具體涉及一種玉米心葉特異性啟動子的克隆及其功能分析。

背景技術(shù)

玉米不僅是糧、飼兼用的主要作物，而且還是重要的工業(yè)原料。隨著工業(yè)化的普及和加快，耕地面積的減少、環(huán)境的惡化和食物短缺的矛盾日益尖銳，而常規(guī)育種技術(shù)無法滿足人類對玉米新品種高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、抗病抗逆的需求。十多年來，已經(jīng)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育出一批抗蟲、抗病、抗除草劑、抗鹽、抗旱、優(yōu)質(zhì)的玉米新品種。

玉米螟(即玉米鉆心蟲)是玉米的主要害蟲之一，對玉米危害極大，可導(dǎo)致玉米減產(chǎn)10％以上。而由于玉米對玉米螟的內(nèi)源抗性受多基因控制，常規(guī)育種方法不僅周期長，且抗性與高產(chǎn)負(fù)相關(guān)，抗瞑育種難度較大，20年間各國均未取得明顯進展。

進入20世紀(jì)90年代，通過轉(zhuǎn)基因方法將來源于蘇云金芽孢桿菌的Bt毒蛋白基因?qū)胗衩滓垣@得抗蟲品種取得突破性進展，轉(zhuǎn)Bt基因玉米抗蟲效果明顯，平均增產(chǎn)5-10％。然而轉(zhuǎn)基因植物的安全性一直是人們關(guān)注的焦點，其中外源基因的表達(dá)有可能改變植物自身的代謝，從而帶來目前不為人所知的潛在風(fēng)險。

為了更安全、高效防治玉米螟，將外源基因表達(dá)對植物和環(huán)境的影響降到更低，在轉(zhuǎn)基因載體中使用心葉特異表達(dá)基因的啟動子代替組成型CaMV35S啟動子驅(qū)動Bt毒蛋白的表達(dá)，不僅可以控制在幼嫩心葉中為害的第一代玉米螟初孵幼蟲，而且可以將外源基因表達(dá)帶來的潛在風(fēng)險降到最低。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種玉米心葉特異性啟動子，該啟動子可驅(qū)動基因在玉米心葉中特異高表達(dá)。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種玉米心葉特異性啟動子，來源于玉米(Zea?mays?ssp.Mays?L.)，具有如下a)或b)的核苷酸序列：

a)序列表中SEQ?ID?No：1所示的核苷酸序列；

b)在嚴(yán)格條件下與序列表中SEQ?ID?No：1限定的DNA序列雜交，且具有相同功能的核苷酸序列。

所述嚴(yán)格條件為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃條件下雜交并洗膜。

序列表中的SEQ?ID?No：1長1976bp。

含有本發(fā)明啟動子的表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系和宿主菌均屬于本發(fā)明的保護范圍。

本發(fā)明通過實時熒光定量PCR(real-time?fluoresent?quantitative?polymerase?chain?reaction，F(xiàn)Q-PCR)技術(shù)進行分析，發(fā)現(xiàn)ZmPEP1基因在玉米幼嫩的心葉中特異性高表達(dá)，克隆該基因的啟動子，命名為WS1-ZmPro，其序列如SEQ?ID?No：1所示。

本發(fā)明的啟動子具有心葉組織特異性，可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因植物育種領(lǐng)域，通過構(gòu)建含有該啟動子的植物表達(dá)載體，將其轉(zhuǎn)化到植物(例如玉米)中，驅(qū)動下游基因在植物心葉中特異性高表達(dá)，達(dá)到育種目的，例如驅(qū)動Bt毒蛋白的基因在玉米心葉中特異性高表達(dá)，從而獲得安全、高效抗玉米螟的轉(zhuǎn)基因玉米。

附圖說明

圖1顯示了ZmPEP1基因在玉米各組織中的相對表達(dá)量。

具體實施方式

下面通過實施例，結(jié)合附圖對本發(fā)明做進一步詳細(xì)描述，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

本實施例通過實時熒光定量PCR(FQ-PCR)驗證了ZmPEP1基因在玉米幼嫩心葉中的特異高表達(dá)，從而克隆出其啟動子，該啟動子長1976bp，序列見序列表中SEQ?ID?No：1。

一、材料

玉米(Zea?mays?ssp.Mays?L.)，在26℃溫室中生長4周，每天光照16小時，黑暗8小時。

二、總RNA的提取及cDNA合成

1、玉米各組織總RNA的提取

取4周齡玉米的根、莖以及心葉，分別在液氮中將2g新鮮潔凈的玉米組織研磨為粉末，轉(zhuǎn)移到1ml?Trizol溶液(invitrogen公司)中，混勻，加入200μl氯仿，充分混勻，室溫下靜置2分鐘，4℃、12000g離心15分鐘，吸出上清，轉(zhuǎn)移到新的eppendorf管中，加入500μl異丙醇，混勻，4℃、12000g離心10分鐘，棄上清，加入1000μl?75％乙醇洗滌一次，棄上清，所得RNA沉淀溶于50μl?DEPC-ddH₂O中。

2、cDNA合成