[發(fā)明專利]小麥谷粒中禾谷鐮孢菌侵染量的定量檢測技術(shù)

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010247054.X
• 申請日: 2010-08-06
• 公開（公告）號: CN101988121A
• 公開（公告）日: 2011-03-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 周明國;陳長軍;王建新;張艷軍
• 申請（專利權(quán)）人: 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/06
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.小麥谷粒中禾谷鐮孢菌侵染量的定量檢測方法，其特征在于采用實時定量PCR(Real-time?quantitative?PCR)技術(shù)檢測谷粒中禾谷鐮孢菌菌絲的侵染量。

谷粒中禾谷鐮孢菌檢測方法，共分三步：

第一步：采用常規(guī)的苯酚·氯仿·異戊醇法，分別提取實驗室培養(yǎng)的禾谷鐮孢菌菌絲DNA和待測谷物樣品DNA。

第二步：運用禾谷鐮孢菌特異性DON毒素合成關(guān)鍵基因Tri5(編碼單端孢霉二烯合酶)的特異性檢測引物和SYBR?Green?I為發(fā)光材料進行實時定量PCR反應(yīng)，建立禾谷鐮孢菌菌絲檢測量的標準曲線。

實時定量PCR反應(yīng)體系及其擴增條件：

禾谷鐮孢菌菌絲檢測量的標準曲線

反應(yīng)體系：

dH₂O(滅菌蒸餾水)???????????????????????????9.5μL

Platinum^TM?SYBR?Green?qPCR?SuperMix-UDG????12.5μL

Tr5F(10μM)????????????????????????????????0.5μL

Tr5R(10μM)????????????????????????????????0.5μL

ROX?Reference?Dye??????????????????????????1μL

DNA模板????????????????????????????????????1μL

??????????????????????????????????????????????????????

總體積?????????????????????????????????????25μL

擴增條件：

預(yù)熱：????????50℃????2min

預(yù)變性：??????95℃????2min

??????????????↓

變性：????????95℃????15s

退火：????????60℃????30s

延伸：????????72℃????45s

35個循環(huán)

??????????????↓

最后一步延伸：72℃????5min

熔解溫度：????59℃

第三步：待測樣品完成實時定量PCR反應(yīng)后，應(yīng)用第二步中已經(jīng)建立好的標準曲線，計算出待測樣品中禾谷鐮孢菌的菌絲量。

2.根據(jù)權(quán)利要求1，小麥谷粒中禾谷鐮孢菌侵染量的定量檢測方法，其特征在于：基于DNA與菌量成正比的原理，利用了所研發(fā)的能夠特異性擴增禾谷鐮孢菌Tri5基因的引物對(上游引物Tr5F：5’-AGCGACTACAGGCTTCCCTC-3’和下游引物Tr5R：5’-AAACCATCCAGTTCTCC?ATCTG-3’)測定待測樣品中禾谷鐮孢菌的量。

3.根據(jù)權(quán)利要求1和2，小麥谷粒中禾谷鐮孢菌侵染量的定量檢測方法，其特征在于：利用禾谷鐮孢菌侵染量的PCR檢測結(jié)果評價小麥罹病程度和有關(guān)防治技術(shù)的效果。