[發明專利]禾谷鐮孢菌對多菌靈抗藥性基因頻率的高通量分子檢測

無效

• 申請號: 201010247003.7
• 申請日: 2010-08-06
• 公開（公告）號: CN101985652A
• 公開（公告）日: 2011-03-16
• 發明（設計）人: 周明國;陳長軍;王建新;羅卿權
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.禾谷鐮孢菌(Fusarium?graminearum)對多菌靈抗藥性基因頻率的高通量分子檢測方法，其特征在于采用實時定量PCR(Real-time?quantitative?PCR)技術檢測病樣中禾谷鐮孢菌群體對苯并咪唑類殺菌劑產生抗藥性的基因頻率。

該檢測方法共分三步：

(1)采用常規的苯酚·氯仿·異戊醇法，分別提取已知抗藥性菌株、敏感性菌株和待測樣品的核基因組DNA。

(2)運用引物和設計的特異性Cycling?Probe進行實時定量PCR反應，分別建立抗藥性菌株和敏感菌株檢測的標準曲線。

實時定量PCR(Real-time?quantitative?PCR)反應體系及其擴增程序：

反應體系：

10×CycleavePCR?Buffer???????????2.5μL

dNTP?Mixture(各2.5mM)????????????3μL

Mg?Solution(25mM)????????????????5μL

Codon167F(10μM)?????????????????0.5μL

Codon167R(10μM)?????????????????0.5μL

P1(5μM)?????????????????????????0.6μL

P2(5μM)?????????????????????????1μL

TliRNase?H?II(200U/μl)??????????0.5μL

TaKaRa?Ex?Taq^TM?HS(5U/μl)???????0.25μL

DNA模板(敏感和抗性菌株各加入1μL)2.0μL

dH₂O(滅菌蒸餾水)?????補足至總體積25μL

???????????????????????????????????????

擴增條件：

預變性：95℃???????????30s

??????????????↓

變性：95℃?????????????5s

退火：55℃?????????????20s

延伸：72℃?????????????31s

40個循環

(3)待測樣品運用上述體系和條件進行實時定量PCR反應，對照已經建立好的兩個標準曲線，求出相應的抗藥性菌株和敏感性菌株的數量和抗藥性菌株在禾谷鐮孢菌總量中的比例。

2.根據權利要求1，禾谷鐮孢菌對多菌靈抗藥性基因頻率的高通量實時檢測技術其特征在于：用于實時定量PCR的Cycling探針具有特異性。設計的依據是抗藥性菌株β₂-微管蛋白基因的第167位氨基酸密碼子發生突變，由TTT(Phe)→TAT(Tyr)。

①擴增禾谷鐮孢菌β₂-微管蛋白基因片斷的引物對

Codon167F?5′AAGCCATTGATGTTGTTCG?3′

Codon167R?5′CATGACGGTAGAAATCAGGTAG?3′

②特異性Cycling探針

P1??5’-(FAM)CATAACGGAAAGG(Eclipse)-3’

P2??5’-(HEX)CATAACGGAAAGG(Eclipse)-3’