[發(fā)明專利]一種簡化的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的規(guī)模化制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010246359.9
• 申請日: 2010-08-06
• 公開（公告）號: CN101914496A
• 公開（公告）日: 2010-12-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 魏斯溧;高宏;王麗;胡建霞;張學(xué)峰;張美榮
• 申請（專利權(quán)）人: 青島奧克生物開發(fā)有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種間充質(zhì)干細(xì)胞的規(guī)模化制備方法。

背景技術(shù)

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal?stem?cells，MSC)是干細(xì)胞家族的重要成員，來源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層。MSC最初在骨髓中發(fā)現(xiàn)，因其具有多向分化潛能、造血支持和促進干細(xì)胞植入、免疫調(diào)控和自我復(fù)制等特點而日益受到人們的關(guān)注。如間充質(zhì)干細(xì)胞在體內(nèi)或體外特定的誘導(dǎo)條件下，可分化為脂肪、骨、軟骨、肌肉、肌腱、韌帶、神經(jīng)、肝、心肌、內(nèi)皮等多種組織細(xì)胞，連續(xù)傳代培養(yǎng)和冷凍保存后仍具有多向分化潛能，可作為理想的種子細(xì)胞用于衰老和病變引起的組織器官損傷修復(fù)。

間充質(zhì)干細(xì)胞臨床應(yīng)用于解決多種血液系統(tǒng)疾病，糖尿病及糖尿病足，心血管疾病，肝硬化，脊髓損傷，帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)疾病，膝關(guān)節(jié)半月板部分切除損傷修復(fù)，自身免疫性疾病等方面取得了重大突破，挽救了許多病患的生命。

間充質(zhì)干細(xì)胞廣泛分布于胎兒和成體的骨髓、骨膜、松骨質(zhì)、脂肪、滑膜、骨骼肌、胎肝、乳牙、臍帶、臍帶血中，其中臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞質(zhì)量高、純凈、數(shù)量多。臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞不但能夠成為骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的理想替代物，而且具有更大的應(yīng)用潛能。

臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表達多種胚胎干細(xì)胞的特有分子標(biāo)志，具有分化潛力大、增殖能力強、免疫原性低、取材方便、無道德倫理問題的限制等特征，因此有可能成為最具臨床應(yīng)用前景的多能干細(xì)胞。但臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離提取過程繁瑣且提取效率低，間充質(zhì)干細(xì)胞的規(guī)模化制備成了其廣泛應(yīng)用的瓶頸。

目前間充質(zhì)干細(xì)胞制備多采用酶消化法和組織貼壁法來制備。酶消化法提取臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞是將臍帶組織剪成碎塊后，用胰蛋白酶和膠原酶消化1-2小時，用含胎牛血清的培養(yǎng)基終止酶消化，然后洗滌細(xì)胞棄去消化酶，洗滌后的細(xì)胞接種至培養(yǎng)器皿中進行培養(yǎng)擴增。洗滌細(xì)胞需時約1小時，且洗滌過程中對細(xì)胞損傷較重，操作步驟繁瑣，易污染，消化酶對細(xì)胞損傷亦較重，最終導(dǎo)致獲得的細(xì)胞活力低、增殖慢。組織貼壁法是目前應(yīng)用比較廣泛的一種方法，傳統(tǒng)的組織貼壁法是將臍帶組織剪碎，要求組織剪碎程度很高，要剪至肉糜狀，剪切時間在30min以上，耗時費力；離心洗去組織液后接種培養(yǎng)，間充質(zhì)干細(xì)胞貼壁生長較慢，多需要10-14天。

酶消化法制備間充質(zhì)干細(xì)胞耗時長，操作過程中對細(xì)胞損傷較大，使得分離得到的間充質(zhì)干細(xì)胞活力低、增殖慢。組織貼壁法要求臍帶組織剪碎程度很高，操作費力，且細(xì)胞貼壁慢，生長慢。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明人針對上述缺點，廣泛查閱大量國內(nèi)外文獻，在現(xiàn)有間充質(zhì)干細(xì)胞制備技術(shù)的基礎(chǔ)上，改進組織貼壁法制備技術(shù)，使組織塊剪切過程不再費力，且在培養(yǎng)液中添加bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長因子)，可以加快細(xì)胞的貼壁和生長，就使得整個原代培養(yǎng)時間由原來的10-14天大為縮短。

本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供一種臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的制備方法，包括以下步驟：

1)新鮮臍帶，用PBS緩沖液沖洗；所述PBS緩沖液含100kU/L青霉素及100mg/L鏈霉素；

2)剪取6-8cm長臍帶，將臍帶剪成2cm長的小段，用PBS緩沖液反復(fù)沖洗；所述PBS緩沖液含100kU/L青霉素及100mg/L鏈霉素；

3)將臍帶組織塊剪碎成2-3mm³小塊；

4)將剪碎組織加入L-DMEM培養(yǎng)基洗滌，在650g條件下離心5分鐘，棄上清；

5)將組織塊和培養(yǎng)基按體積比2.5-3∶1比例加入培養(yǎng)基，混勻組織塊，接種至細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)；所述的培養(yǎng)基為含1-10ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)及體積百分比10％-15％胎牛血清(FBS)的L-DMEM培養(yǎng)基；

6)24小時后補加步驟5所述的培養(yǎng)基。

7)每3天換一次培養(yǎng)基，第6天后換含體積比10％胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基，至8-9天細(xì)胞達80％左右融合時傳代；傳代培養(yǎng)基為含體積比10％胎牛血清的L-DMEM培養(yǎng)基；

8)以后每3天傳代一次。

附圖說明

圖1：人臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)：(A-C)是采用本發(fā)明的方法獲得的間充質(zhì)干細(xì)胞原代第4、5、7天的細(xì)胞形態(tài)；(D-F)是間充質(zhì)干細(xì)胞第一代第1、2、3天后的細(xì)胞形態(tài)；(G)是間充質(zhì)干細(xì)胞第二代第3天的細(xì)胞形態(tài)；(H-J)是間充質(zhì)干細(xì)胞第三代第1、2、3天的細(xì)胞形態(tài)。

圖2：人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞生長曲線

圖3：流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞表型分析

技術(shù)效果