[發(fā)明專利]肝炎病毒體外培養(yǎng)模型及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010245845.9
• 申請日: 2010-08-05
• 公開（公告）號: CN101914489A
• 公開（公告）日: 2010-12-15
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李君文;金敏;郭向飛;王姝;陳照立;邱志剛;諶志強;王新為;王景峰
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號: C12N5/0735
• 分類號: C12N5/0735;C12Q1/70;C12Q1/68;C12Q1/02
• 代理公司: 天津市三利專利商標(biāo)代理有限公司 12107
• 代理人: 閆俊芬

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及體外培養(yǎng)模型及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，尤其是肝炎病毒體外培養(yǎng)模型及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。

背景技術(shù)

眾所周知，乙型肝炎病毒(HBV)是引起肝臟疾病的最主要原因之一，全球大約有3.5億人是慢性HBV攜帶者，嚴(yán)重的可導(dǎo)致肝硬化、原發(fā)性肝癌。病毒性乙型肝炎流行面廣，傳染性強，是世界上最常見的感染性疾病之一，人一旦被乙肝病毒感染，肝臟就會發(fā)生炎性病變，肝細胞受損，對人體造成極大的危害，因此研究HBV的發(fā)病機制及其防治方法具有重要的意義。

研究HBV生物學(xué)特性、乙型肝炎發(fā)病機制、體外抗HBV藥物篩選及其防治方法的重要環(huán)節(jié)之一就是要建立方便有效的HBV體內(nèi)外培養(yǎng)模型。現(xiàn)在用于研究HBV的動物培養(yǎng)體內(nèi)模型，主要有靈長類、樹鼩、鴨和應(yīng)用最多的轉(zhuǎn)基因小鼠模型及人鼠嵌合肝模型；建立模型的細胞包括成人肝細胞、胎肝細胞、HepRG細胞系及以HepG-2為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)基因細胞。動物模型雖然能模擬體內(nèi)HBV感染過程，但是仍存在HBV復(fù)制表達水平不高，種間差異及免疫缺陷等問題。而建立的細胞培養(yǎng)體外模型，由于均存在不同程度的局限性，因而仍然沒有合適理想的模型，如成人肝細胞是一類終末分化的細胞，不能傳代培養(yǎng)，且在肝細胞鋪板后，成熟肝細胞的功能如白蛋白產(chǎn)生能力下降、失去典型多角形態(tài)，對病毒敏感性也逐漸下降，因此限制其實際應(yīng)用；胎肝細胞也終究因為不能傳代培養(yǎng)而在應(yīng)用中受到制約；HepRG細胞系模型不僅不能獲得完整的HBV顆粒，而且難以去除添加物對HBV感染過程的可能影響；而在目前應(yīng)用最廣的以HepG-2為基礎(chǔ)的HepG2.2.15轉(zhuǎn)基因細胞中，由于HBV整合在宿主細胞染色體上且不能被清除，因而其復(fù)制方式與自然感染不同，細胞培養(yǎng)中不產(chǎn)生cccDNA(復(fù)制中間體)，病毒復(fù)制水平低，另外，HBV與轉(zhuǎn)染肝癌細胞長期穩(wěn)定的整合狀態(tài)難以用于研究細胞的轉(zhuǎn)化機制。

此外，人們還探討了HBV感染的非肝源性細胞，并且，越來越多的研究表明，HBV不僅感染肝源性細胞，也可以感染其它如骨髓干細胞、內(nèi)皮祖細胞、胎盤滋養(yǎng)層細胞等具干細胞特性的細胞，但是，由于HBV不能或很難在這些細胞中復(fù)制繁殖，且這些細胞為非肝臟源細胞，HBV感染機制可能不同，因此仍然不能用于建立理想的細胞培養(yǎng)模型。

丙型肝炎病毒(HCV)也呈全球性流行，根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計，HCV在人群中的感染率約為3％，全球約有1.7億人感染HCV，每年新發(fā)病型肝炎病例約3.5萬例。我國進行的全國HCV血清流行病學(xué)調(diào)查顯示，我國一般人群抗HCV陽性率為3.2％，約有4000萬人感染HCV。HCV是引起人類慢性肝炎和輸血后肝炎的主要病原體之一，約60％的急性丙型肝炎患者轉(zhuǎn)化為慢性，而慢性患者中分別有8-46％和11-19％發(fā)展成肝硬化和肝細胞癌。

由于HCV在被感染組織和血清中濃度較低，HCV的高度變異，缺乏穩(wěn)定的HCV體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)及理想的實驗動物模型等問題，阻礙了對HCV的進一步研究。除人之外，黑猩猩是目前報道的唯一可以感染HCV的實驗動物，由于來源不便，耗資巨大，使其應(yīng)用受到限制。

到目前為止，以干擾素為主的抗病毒治療只能使30％左右的患者得到根治，尚未發(fā)現(xiàn)令人滿意的治療藥物和有效疫苗。因此，迫切需要尋找預(yù)防和治療HCV感染的有效方法。而其關(guān)鍵是建立穩(wěn)定的維持病毒復(fù)制和傳代的細胞模型，以深入了解丙肝病毒的生命周期和發(fā)病機理。

HCV體外細胞培養(yǎng)模型研究現(xiàn)狀是：1肝源細胞模型，即包括原代肝細胞、胎肝細胞，但因為其復(fù)制水平低，也不穩(wěn)定，不能滿足藥物篩選研究的要求；肝癌細胞系則不能用于感染機制的研究。2HCV基因組轉(zhuǎn)染模型：包括Huh-7細胞轉(zhuǎn)染HCV?JFH-1?RNA、胎肝細胞轉(zhuǎn)染無適應(yīng)性突變的HCV?RNA但缺陷在于僅HCV?2a、1a型可傳代培養(yǎng)，細胞培養(yǎng)所分泌的病毒顆粒較之動物實驗高同質(zhì)性和低感染性。3肝外細胞模型包括人淋巴細胞、纖維母細胞、單核白血病細胞、膽管癌細胞、T細胞系、PBMC但病毒感染非肝細胞的方式和途徑是否與體內(nèi)感染肝細胞相似，且在非肝細胞中長期培養(yǎng)的HCV，其生物學(xué)特性是否發(fā)生改變迄今尚不清楚。