[發明專利]一種篩選紅蓮型細胞質雄性不育水稻新型恢復基因的方法

無效

• 申請號: 201010245020.7
• 申請日: 2010-08-03
• 公開（公告）號: CN101899522A
• 公開（公告）日: 2010-12-01
• 發明（設計）人: 李紹清;譚艷平;謝紅衛
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;A01H1/02
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

1.一種篩選紅蓮型細胞質雄性不育水稻新型恢復基因的方法，它包括下列步驟：

A、共分離分子標記的PCR引物設計：

設計紅蓮型細胞質水稻恢復基因Rf5和Rf6共分離的分子標記引物，序列如下：

引物P1：Rf5，53℃

P1F：5’-ATGACAAATCTGCTCCGATG-3’

P1R：5’-CTTACTTAGGAAAGACTAC-3’

引物P2：Rf6，56℃

P2F：5’-GGAGATGCTATAGCAGCAGTG-3’

P2R：5’-ATTGCTCCTTACCACCTTGC-3’；

B、PCR擴增反應體系的建立：

標準的PCR擴增反應體系共15μl，組成如下：50ng/μl的總DNA?1μl，10×PCRbuffer1.5μl，25mM?MgCl₂?0.6μl，25μm?dNTP?0.6μl，1U/μl?Taq酶0.6μl，5pM的引物F?1μl，5pM的引物R?1μl，去離子ddH₂O?8.7μl：

反應混合物用礦物油覆蓋，PCR反應程序如下：

1cycle：94℃?5min

30cycle：94℃?1min；53或56℃1min；72℃?1min

1cycle：72℃?5min

store：4℃；

C、擴增DNA片段檢測候選恢復位點：

(a)、以含紅蓮恢復基因Rf5的密陽23和含Rf6的9311作對照，與恢復基因共分離的分子標記對所有檢測水稻品種進行PCR擴增，擴增產物在3.5％(w/v)的瓊脂糖膠上電泳；

(b)、將檢測品種擴增的帶型分別與密陽23中Rf5、9311中Rf6共分離的分子標記帶型進行比較：水稻品種分子標記的帶型與紅蓮型恢復基因Rf5、Rf6帶型不同，確定該品種攜帶與已知的紅蓮Rf5、Rf6不等位的新型候選恢復基因；

D、遺傳分析確證新型恢復基因：

(1)將選擇篩選的含差異標記的候選恢復系與紅蓮不育系粵泰A測交，套袋確定育性，測交組合，該候選恢復系含新型恢復基因R’；

(2)將該候選新型恢復基因恢復系R’與Rf5親本密陽23和Rf6親本9311雜交，配制雜種F1，即：Rf5：R’/密陽23；Rf6：R’/9311；

(3)以紅蓮不育系粵泰A作母本與相應的每個雜種F1測交，將測交組合種植150株的群體，觀察育性分離，兩個群體中都出現不育株，候選恢復系中所含的恢復基因與Rf5和Rf6不等位，屬于新的恢復基因R’。